一株纖維素酶真菌的篩選鑒定及產酶條件優化

羅奉奉，付 躍，黃秀艷，黃文彬，陳慧珍，覃擁靈，3*

（1.河池學院 化學與生物工程學院，廣西 河池 546300；2.微生物及植物資源開發利用廣西高校重點實驗室，廣西 河池 546300；3.河池學院 農業生物技術應用研究中心，廣西 河池 546300）

地球上每年纖維素的產量約為2 000億t，如果不加以利用，不但會造成資源浪費，還會污染環境。纖維素的處理與利用是解決糧食短缺、能源危機、環境污染和生態平衡等問題的有效途徑[1-3]。纖維素結構復雜，難以分解，是制約其應用的主要原因[4]，因此如何高效的利用纖維素成為研究熱點[5]。目前通常采用酸堿化處理等化學方法和汽爆及蒸汽加熱等物理手段降解纖維素，不僅成本高，而且對環境不友好[6-8]。纖維素酶能將纖維素水解成容易利用的單糖或寡糖，可作為動物飼料使用，也可作為發酵生產乙醇的原料，對解決能源問題具有重要意義。除此之外，纖維素酶廣泛應用于造紙、紡織、食品等領域[9-10]。纖維素酶是一類多種酶相互協同作用的酶系，主要包括葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，在這三類酶的協同作用下能夠將纖維素降解為葡萄糖，葡聚糖內切酶作用于纖維素的非結晶區，將纖維素切割成聚合度不同的短鏈纖維素；葡聚糖外切酶從短鏈纖維素的非還原端開始水解β-1,4糖苷鍵，釋放纖維二糖；最后在β-葡萄糖苷酶的作用下將纖維二糖水解為葡萄糖[11-12]。

高產纖維素酶菌株少，因此篩選高產纖維素酶產生菌成為研究熱點。微生物蘊含豐富的纖維素酶資源，研究表明，能夠分泌纖維素酶的微生物主要為真菌，包括木霉屬（Trichoderma），青霉屬（Penicillium），曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）等[10]，雖然真菌比細菌生長周期長[13]，且易污染，但其酶系較全。因此，本研究以原始森林土壤樣品為材料，經初篩、復篩，成功篩選到一株高產纖維素酶產生真菌，并進行分子生物學鑒定，且通過單因素和正交試驗確定最佳產酶條件，為木質纖維素的高效利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：采集自廣西環江縣原始森林腐爛木材下的土壤；甘蔗渣：南寧糖業股份有限公司東江糖廠。

1.1.2 化學試劑

羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）（分析純）：山東西亞化學股份有限公司；剛果紅（分析純）：中國遠航試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復精細化工研究所；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司；四水酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；whatman一號濾紙：天津歐杰科技有限公司；微晶纖維素（分析純）、水楊苷（分析純）：成都格列普生物科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：削皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨0.5 g/L，酵母膏4.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂10 g/L，水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

篩選培養基：CMC-Na 2 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，水1 000 mL，瓊脂15 g，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

固體發酵培養基：按質量分數配制40 g，蔗渣15%，麩皮10%，Mandels營養鹽液75%。115 ℃滅菌30 min。

Mandels營養鹽液：（NH4）2SO41.4 g/L，KH2PO42 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO41.6 mg/L，CoCl22.0 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，蒸餾水1 000 mL。115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

AYP124電子天平：日本島津公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；J-E冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DW-86L388A海爾醫用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；BCD-322WRM2MPCA冰箱：廣東海信冰箱營銷有限公司；EasyCycler梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國AnalytikJena公司；DYCP-31DN電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 初篩

將采集的土樣用研缽研細，準確稱量10 g土樣于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養30 min，梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取10-3、10-4、10-5、10-6梯度各100 μL涂布于以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的篩選平板上，置于30 ℃的生化培養箱中倒置培養7 d。用接種環挑取菌落在PDA平板上劃線，于28 ℃的生化培養箱中倒置培養3 d，每個梯度做3個平行。用無菌牙簽挑取單菌落接種于新的篩選平板上，于28 ℃生化培養箱中倒置培養3 d。待長出菌落后用0.2%的剛果紅溶液染色30 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min，測定水解圈直徑與菌落的直徑，并計算其比值（H值）。從中選取H值較大的菌株進行復篩[14]。

將初篩得到的菌種劃線分離至PDA平板上，倒置于30℃培養箱中倒置培養4 d。菌種成熟后接種于PDA斜面中，同樣條件下培養4 d，待菌株成熟后于4 ℃冰箱保存備用[15]。

1.3.2 復篩

取PDA斜面，用10 mL生理鹽水將菌體洗下，取1 mL菌懸液接種至發酵培養基中，置于30 ℃的生化培養箱中培養5 d，每天早晚各翻動一次，每株菌做3個平行。發酵完成后向三角瓶中加入200 mL無菌水，40 ℃恒溫水浴1 h，4層紗布過濾，將濾液在6 000 r/min，4 ℃的條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，4 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 分析檢測

根據文獻[16-17]測定粗酶液葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活。

葡聚糖內切酶酶活測定：采用0.02 mol/L的pH4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制1%CMC-Na為底物，測定內切葡聚糖酶活力。將1 mL 1%CMC-Na置于50 ℃的水浴鍋中預熱5min，加入0.5mL適當濃度酶液，50 ℃保溫反應30 min；待反應結束后，立即加入3 mL的DNS試劑，補足去離子水定容10 mL體積，沸水浴5 min，用自來水冷卻至室溫，測定波長540 nm條件下的吸光度值，依據葡萄糖標準曲線計算反應產生的葡萄糖濃度確認酶活。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

β-葡萄糖苷酶酶活測定：采用0.02 mol/L的pH4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制1%水楊苷溶液為底物，0.5 mL適當濃度的酶液和1%水楊苷溶液1 mL底物混勻，50 ℃反應30 min，添加3 mL DNS試劑終止反應，沸水浴6 min 然后冷水浴，測定波長540 nm處的吸光度值。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

濾紙酶酶活測定：將1條whatman一號濾紙條[1cm×6cm；（50±1）mg]折疊放入試管底部，加1 mL pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和0.5mL適當濃度的酶液混勻，30 ℃反應60 min；對照管為沸水浴6 min滅活的粗酶液。然后用DNS法測定還原糖的生成量，比對葡萄糖標準曲線計算反應產生的葡萄糖濃度確認酶活。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

還原糖含量測定采用DNS法[18-19]。

1.3.4 菌株分子生物學鑒定

菌株選用通用引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）、ITS4（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴增ITS序列。PCR擴增體系：Template1μL，引物各1μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，進行30次循環；72 ℃再延伸10 min，PCR產物8 ℃保溫60 min。用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠驗證PCR產物，將驗證成功的產物送華大基因公司測序。利用Cluster W軟件將測序拼接后的序列與GenBank中的相似序列進行多種比對，再通過MEGA7.0軟件中基于Kimura-2的鄰接（neighborjoining，NJ）法（bootstrap=1000次）構建具有產纖維素酶活的菌株以及相關相似菌株的系統進化樹[20-21]。

1.3.5 混合碳源對發酵產酶的影響

選取蔗渣、玉米桿、米糠、花生殼共4種碳源[22]各5 g，各加入3 g麩皮作為氮源，各加入30 mL 營養鹽液，121 ℃滅菌30 min，接種107個孢子，每組做3個平行，28 ℃恒溫培養箱發酵3 d后提取粗酶液，采用酶標儀在540 nm處測吸光度值，計算酶活力。按照蔗渣∶麩皮=1∶4的比例，設計四組：1.5%蔗渣+6.0%麩皮（0.5 g蔗渣+2.0 g麩皮），3.0%蔗渣+12.0%麩皮（1.0 g蔗渣+4.0 g麩皮），4.0%蔗渣+16.0%麩皮（1.5 g蔗渣+6.0 g麩皮），5.0%蔗渣+20.0%麩皮（2.0 g蔗渣+8.0 g麩皮），6.0%蔗渣+24.0%麩皮（2.5 g蔗渣+10.0 g麩皮），各加入30 mL營養鹽液。121 ℃滅菌30 min，接種1 mL種子液，每組做3個平行，28 ℃恒溫培養箱發酵3 d。3 d后提取粗酶液，在波長540 nm處測定吸光度值，計算酶活力。

1.3.6 產酶條件優化

在優化好的培養基基礎上考察發酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）、初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%）、Mandels營養鹽液添加量（80%、83%、86%、89%、91%）和發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對纖維素酶（葡聚糖內切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶酶）酶活的影響[22-23]。一般情況下，濾紙酶活能夠表現纖維素酶的綜合酶活力，因此在單因素優化的基礎上，以濾紙酶活（Y）為評價指標[24]，分別選取發酵溫度（A）、初始pH（B）、接種量（C）和發酵時間（D）為考察因素設計正交試驗，采用L9（34）正交試驗設計，優化菌株產酶條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 產纖維素酶條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cellulase-producing conditions optimization

1.3.7 數據處理

數據采用3次試驗的重復平均值和標準差進行統計，分析采用Microsoft Excel 2016、正交設計助手V3.1進行試驗設計和結果分析。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩

鑒定平板上長出菌落后，經剛果紅染色液染色，氯化鈉溶液脫色后產生明顯透明圈，水解效果圖見圖1。

圖1 纖維素酶產生菌水解效果Fig.1 Hydrolysis circle of cellulase-producing strain

篩選平板以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，羧甲基纖維素鈉能夠被剛果紅染成紅色，由于該菌株能夠分泌纖維素酶，故將周圍的羧甲基纖維素鈉分解，不能著色，產生水解圈，水解圈直徑與菌落直徑比值越大說明酶產量越高，因此可以根據透明圈直徑與菌落直徑的比值定性判定高產菌株，部分高產菌株經剛果紅染色、氯化鈉脫色后產生的透明圈直徑與菌落直徑比值見表2。

表2 部分篩選菌株的H值Table 2 H value of some screened strains

續表

由表2可知，經過羧甲基纖維素平板初篩，剛果紅染色后，酶產量較高的為菌株HJC-46、HJC-79、HJC-106，其透明圈直徑與菌落直徑比值分別為4.92、4.23和4.30。因此，選擇這3株菌做進一步復篩。

2.2 菌種復篩

將初篩結果比較好的3株菌進行發酵產酶復篩，結果見圖2。由圖2可知，葡聚糖內切酶酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC106＞HJC46；β-葡萄糖苷酶酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC46＞HJC106；濾紙酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC106＞HJC46。濾紙酶活代表綜合酶活力，從發酵結果來看，3株菌中菌株HJC-79結果最好，其葡聚糖內切酶酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力和濾紙酶活分別為0.986 U/mL、1.092 U/mL、0.563 U/mL。因此，選擇菌株HJC-79進行下一步試驗。

圖2 篩選菌株發酵產酶結果Fig.2 Results of enzyme production of screened strains

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落形態

將菌株HJC-79接種于PDA平板上，于30 ℃的生化培養箱中倒置培養3 d，菌落形態見圖3。

圖3 菌株HJC-79菌落（a）和細胞（b）形態Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of strain HJC-79

由圖3可知，菌株HJC-79從篩選板中選出接種于PDA培養基上，待長出菌落后觀察，該菌落呈灰白色和圓形，邊緣不齊整，呈齒狀，表面光滑，不透明，而細菌的背部呈淡黃色；顯微鏡觀察菌絲光滑，分支狀，分生孢子頭為放射狀，頂囊呈半橢圓形或半圓形；分生孢子為球形或近球形。初步鑒定為曲霉屬（Aspergillussp.）。

2.3.2 分子生物學鑒定

采用MEGA7.0軟件中NJ法構建系統進化樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株HJC-179與雜色曲霉菌MF22539聚于一支，經測序對菌株HJC-79的ITS序列進行比對分析，從GenBank數據庫中選取部分相似序列，發現菌株HJC-79 ITS序列與之相似性最高，高達100%。因此，鑒定菌株HJC-179為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。

圖4 菌株HJC-79基于ITS基因序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain HJC-79 based on ITS gene sequences

2.4 培養基組分對菌株HJC-79發酵產酶的影響

碳源能誘導纖維素酶合成。玉米桿、蔗渣、花生殼、米糠作為唯一碳源，不同碳源對纖維素酶酶活的影響見圖5。

圖5 不同碳源對纖維素酶酶活的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on cellulase activity

由圖5可知，蔗渣為唯一碳源時，葡聚糖內切酶、濾紙酶活及β-葡萄糖苷酶3種酶活力相對較高，分別是1.234 U/mL、1.282 U/mL、0.663 U/mL，因此確定最佳碳源為蔗渣。

碳氮比是有機物中碳總含量與氮總含量的比值，對微生物生長有十分重要的作用。本試驗設計碳氮比=1∶4的比例，固體培養基總質量對酶活的影響見圖6。

圖6 固體培養基總質量對纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of total mass of solid medium on cellulase activity

由圖6可知，在蔗渣∶麩皮=1∶4條件下，3.0%蔗渣+12.0%麩皮（1 g蔗渣+4 g麩皮）發酵生產的3種纖維素酶的酶活力都是最高的，分別為1.39 U/mL、1.456 U/mL、0.782 U/mL。因此，確定3.0%蔗渣+12.0%麩皮作為基本發酵培養基的碳氮源。

2.5 發酵條件對菌株HJC-79發酵產酶的影響

2.5.1 發酵溫度對發酵產酶的影響

溫度對微生物的生長繁殖和新陳代謝都有著至關重要的影響，發酵溫度太低或者太高都會使微生物生長受到不同程度的抑制。本實驗考察不同發酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）對纖維素酶酶活的影響，結果見圖7。

圖7 不同發酵溫度對纖維素酶酶活的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperature on cellulase activity

由圖7可知，隨著發酵溫度在24～33 ℃范圍內的升高，纖維素酶酶活力逐漸升高；當發酵溫度為33 ℃時，葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.523 U/mL、1.456 U/mL、0.828 U/mL；當發酵溫度＞33 ℃之后，纖維素酶活呈現降低趨勢。因此，最適發酵溫度為33 ℃。

2.5.2 初始pH值對發酵產酶的影響

pH對微生物吸收營養物質和新陳代謝過程中酶的活性存在不容忽視的影響，所以適中的pH值對菌種發酵起促進作用。初始pH值對酶活的影響見圖8。

圖8 不同初始pH值對纖維素酶酶活的影響Fig.8 Effect of different initial pH value on cellulase activity

由圖8可知，初始pH值在3～4范圍內，纖維素酶酶活力隨著初始pH升高而升高；當初始pH值為4時，葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.608 U/mL、1.496 U/mL、0.886 U/mL；初始pH值＞4以后纖維素酶酶活呈現下降趨勢。因此，最適初始pH值為4。

2.5.3 接種量對發酵產酶的影響

在一定的發酵體系內，接種量大小受限于代謝、生長和繁殖速度，接種量過小導致發酵周期延長等，過大則導致發酵體系溶氧不足、菌體容易衰老等。適當的接種量能使菌種更好地發酵產酶。接種量對酶活的影響見圖9。

圖9 不同接種量對纖維素酶酶活的影響Fig.9 Effect of different inoculum on cellulase activity

由圖9可知，接種量為1.5%～6.0%時，纖維素酶酶活力隨著接種量升高而升高；當接種量達到6.0%時，葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.712 U/mL、1.584 U/mL、0.954 U/mL；當接種量＞6.0%之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最適接種量為6.0%。

2.5.4 營養鹽液添加量對纖維素酶活的影響

營養鹽液可以給微生物的生長代謝提供營養物質，某些離子可以促進微生物發酵。營養鹽液對纖維素酶酶活的影響見圖10。

圖10 不同營養鹽液添加量對纖維素酶酶活的影響Fig.10 Effect of different nutrient salt solution addition on cellulase activity

由圖10可知，營養鹽液添加量在80%～89%范圍內，纖維素酶酶活力逐漸升高；當營養鹽液添加量為89%時，葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.823 U/mL、1.654 U/mL、1.023 U/mL；當營養鹽液添加量＞89%之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最適營養鹽液添加量為89%。

2.5.5 發酵時間對發酵產酶的影響

微生物在發酵前期，酶慢慢積累，到了發酵后期，菌體可利用的營養物質變少，菌株發生了衰老，發酵時間對酶的產生有重大的影響。發酵時間對纖維素酶酶活的影響見圖11。

圖11 不同發酵時間對纖維素酶酶活的影響Fig.11 Effects of different fermentation time on cellulase activity

由圖11可知，隨著發酵時間在24～48 h范圍內增加，纖維素酶酶活逐漸升高；當發酵時間為48h時，葡聚糖內切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.986 U/mL、1.782 U/mL、1.224 U/mL；當發酵時間＞48 h之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最佳發酵時間為48 h。

2.6 正交試驗優化產酶條件

選取采用正交設計助手V3.0進行試驗方案設計，按照方案進行試驗，每組做3個平行。正交試驗結果見表3。

表3 產酶條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for cellulase-producing conditions optimization

由表3可知，最優產酶條件組合為A2B2C3D2，即發酵溫度為33 ℃，初始pH值為4，接種量為9.0%，發酵時間為48 h。在此優化條件下，葡聚糖內切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活分別為2.224 U/mL、1.926 U/mL、1.534 U/mL。

3 結論

研究從環江原始森林篩選出一株纖維素酶高產真菌HJC-79，經菌落形態觀察、ITS序列分析鑒定其為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。利用單因素實驗和正交試驗對菌株HJC-79的培養基成分和發酵條件進行優化，確定其最佳發酵培養基為蔗渣、麩皮和營養鹽液，最適添加量分別為2%、9%和89%；最佳產酶條件為發酵溫度33 ℃，初始pH值4，接種量9.0%，發酵時間48h。在此優化條件下，葡聚糖內切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活分別為2.224 U/mL、1.926 U/mL、1.534 U/mL，相比優化前分別提高了125.55%、76.37%和172.47%。