不同乳酸菌發酵對菠蘿漿品質的影響

李依娜，鄒 穎，余元善，鄒 波，肖更生，3 *，吳繼軍

（1.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所 農業部功能食品重點實驗室廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；3.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510631）

菠蘿（pineapple）又名鳳梨、露兜子等，是鳳梨科鳳梨屬多年生草本植物。其果肉酸甜可口，氣味芳香獨特，具有生津止渴、健胃助消化的作用[1]。菠蘿原產美洲熱帶地區，我國種植區域主要分布在廣東、福建、廣西、臺灣等省區，是目前華南主產區外銷水果之一[2]。菠蘿富含糖類、有機酸、維生素和礦物質，其飽和脂肪、膽固醇和鈉含量非常低[3-4]。此外，據MHATRE M等[5-6]報道，菠蘿含有的綠原酸、沒食子酸和阿魏酸等豐富酚類化合物，已被證明具有抗氧化、抗誘變、降血脂和抗癌作用。菠蘿漿是制造菠蘿果醬和濃縮菠蘿汁的必經中間產物，目前對于菠蘿的研究以菠蘿復合飲料和菠蘿果酒等加工產品為主，或將菠蘿制粉添加到餅干、糕點中增加風味[7-9]。

乳酸菌（lactic acid bacteria）是發酵碳水化合物產生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性菌的統稱。目前大多數益生菌食品均以乳制品為基礎，但這對于乳糖不耐受或對蛋白質過敏的消費者造成不便。相比之下，乳酸菌發酵果蔬既保留了果蔬本身豐富的營養物質、增加其風味，還賦予了飲品更高的營養保健價值[10]，具有改善胃腸道、抗氧化、控制血清膽固醇含量的益生作用[11]。沈燕飛[12]研究發現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為適宜蘋果原漿發酵的乳酸菌，發酵5 d具有良好的抗氧化活性和感官評價；楊立啟[13]研究表明，植物乳桿菌在柑橘全果汁中具有較強的發酵能力，其發酵體系中黃酮和多酚含量明顯高于另兩者發酵體系。菠蘿全果漿富含膳食纖維，目前對益生菌直接發酵菠蘿漿的研究并不多，隨著人們對于健康飲食關注的提高，傳統的菠蘿加工產品已不能滿足消費者日益增長的需求，因而開拓營養豐富、風味獨特的乳酸菌發酵菠蘿飲料有著廣闊的市場前景[14]。

乳酸菌能夠在天然菠蘿汁中良好生長，無需額外補充營養素。故本實驗直接以菠蘿漿為原料，分別接種不同乳酸菌進行發酵，測定發酵24 h后的酶活力、抗氧化活性和揮發性成分，以探究乳酸菌對發酵菠蘿漿品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿：市售；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，Lc）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）：本實驗室保存；MRS肉湯培養基、酪蛋白：廣東環凱微生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸（標準品）：美國Sigma-Aldrich公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Cary Eclipse型熒光分光光度計：美國VARIAN 公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-1800型分光光度計：日本島津公司；SPX-250B-Z生化培養箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SYNERGY H1多功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；6890N/5975B型氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司；57060-U固相微萃取手動進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取纖維頭：美國SUPELCO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菠蘿漿的制備

挑選成熟度相似的菠蘿（七、八成熟），削皮去眼，將菠蘿洗凈，切片打漿即為菠蘿漿，貯藏于-20 ℃冰柜庫中備用。

1.3.2 菌種培養物制備

3株乳酸菌Lc、Lp和Lm及其保藏物置于滅菌后的MRS肉湯培養基進行活化復壯，30 ℃靜置發酵12 h。

1.3.3 接種及發酵

菠蘿漿分別接種復壯后的Lc、Lp和Lm（菌懸液濃度約為106CFU/mL），進行單一、兩兩復配及三者復配發酵（復合菌種配比為1∶1和1∶1∶1），接種量為0.5%，于30 ℃恒溫靜置發酵24 h。

1.3.4 測定方法

蛋白酶酶活測定：采用福林酚法，參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》進行[15]。

SOD酶活力的測定：采用SOD活性檢測試劑盒測試。將發酵液過濾，取上清液為實驗樣品。樣品液與工作液充分混勻后置于37℃的恒溫水浴40min，再各加入顯色劑2.00mL，最后混勻室溫放置10 min，于波長550 nm處測定吸光度值。采用1 cm直徑比色皿，雙蒸水調零，比色。SOD酶的活力計算公式如下：

總酚含量的測定：參考SINGLETON V L等[16-17]的方法略作修改。準確配制質量濃度為0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的沒食子酸系列標準溶液。各取400 μL標液，分別加入1 mL 1 mol/L的福林酚試劑，用超純水定容至2 mL，室溫條件下避光靜置10 min，加入5 mL 5%Na2CO3溶液，混勻后于室溫條件下反應45 min，利用酶標儀在波長760 nm處測定溶液的吸光度值，以沒食子酸溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。用樣液代替沒食子酸標液重復上述操作，測定樣液的吸光度值，結果以每克樣品中所含的沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mgGAE/g）。

清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的測定：參考SOKOLLETOWSKA A等[18]的方法，取50 μL 50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L Trolox標準溶液或稀釋后的樣品，混合150 μL DPPH溶液共同置于96孔細胞板中，暗處放置30 min后，于波長517 nm處測定吸光度值。結果以每克發酵液中所含的Trolox當量（Trolox equivalent，TE）表示（μmol TE/g）。

維生素C含量的測定：參照傅維等[19]的方法，并作適當修改。精密稱取約0.2 g 粉狀樣品，加入10 mL 2%草酸，搖勻靜置10 min，加0.2 g活性炭，充分振蕩后離心過濾后取上清液。分別吸取樣品濾液1 mL 于試管加入1 mL 250 g/L乙酸鈉溶液，充分混勻，在暗處放置20 min。避光條件下迅速向各試管加入1 mL 0.2 g/L鄰苯二胺溶液，混勻后避光反應40 min，測定各管的熒光強度。根據抗壞血酸標準曲線方程來計算樣品維生素C（mg/g）的含量。

揮發性風味物質分析：采用頂空固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）和氣相色譜-質譜聯用技術分析發酵前后的菠蘿漿/汁的揮發性風味物質[20]。樣品經GC-MS分析，各分離組分利用計算機譜庫（美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）/WILEY）進行檢索，當匹配度＞80%（最大值為100%）時，予以確認并記錄，并采用色譜峰面積歸一化法進行相對定量。

1.3.5 數據處理與分析

以上測定均重復3次，用SPSS 23.0和Origin 2018軟件對實驗數據進行統計分析和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 菠蘿漿發酵后蛋白酶活力的變化

由圖1可知，菠蘿漿經24 h發酵后，蛋白酶活力顯著下降（P＜0.05）；未發酵組蛋白酶活力最高，為946.56 U/mL；干酪乳桿菌和植物乳桿菌單獨發酵菠蘿漿蛋白酶活力分別為813.22 U/mL和821.00 U/mL，略高于腸膜狀明串珠菌單獨發酵及兩種乳酸菌復配發酵菠蘿漿，但差異不顯著（P＞0.05）；3種乳酸菌共同發酵的蛋白酶活力最低，僅為698.78 U/mL。說明添加乳酸菌發酵24 h對增加菠蘿的蛋白酶活力無顯著作用，這可能是乳酸菌自身產蛋白酶能力弱，菠蘿含有豐富的活性菠蘿蛋白酶和礦物質，微量金屬離子對菌體的生長、蛋白酶合成有一定影響，另一方面蛋白酶活性容易受到發酵環境和微生物產熱產氣的影響，故導致了各組蛋白酶活力有所差異[21]。

圖1 不同乳酸菌發酵對菠蘿漿蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the protease activity of pineapple pulp

2.2 菠蘿漿發酵后SOD酶活的變化

由圖2可知，添加乳酸菌發酵對菠蘿漿的SOD酶活性無顯著性影響（P＞0.05），其中干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復配發酵組的SOD酶活性最高，為98.48 U/g，未發酵組的SOD酶活力為97.99 U/g，干酪乳酸菌單獨發酵和腸膜狀明串珠菌單獨發酵的SOD活力分別為97.70 U/g和97.12 U/g。可能是菠蘿漿天然存在超氧自由基清除因子，加乳酸菌發酵24 h后發酵體系的pH值和溶氧量并未影響到SOD酶活性，故菠蘿漿的SOD酶活性仍維持在高水平[22]。

圖2 不同乳酸菌發酵對菠蘿漿超氧化物歧化酶活力的影響Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the SOD activity of pineapple pulp

2.3 菠蘿漿發酵后總酚含量的變化

由圖3可知，菠蘿漿經過不同乳酸菌發酵后總酚含量有所變化。未發酵組的總酚含量為0.47 mg GAE/g，干酪乳桿菌單獨發酵組的總酚含量最高，為0.51 mg GAE/g，其次是植物乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復配發酵組、腸膜狀明串珠菌單獨發酵組，總酚含量分別為0.49 mg GAE/g和0.48 mg GAE/g。3種乳酸菌共同發酵組的總酚含量顯著低于其他發酵組（P＜0.05），為0.44 mg GAE/g。菠蘿漿的總酚含量在添加菌種發酵24 h后有所增加，這可能是在發酵過程中乳酸菌產生了酯酶和酚酸脫羧酶，菠蘿經打漿處理后糖、纖維素及蛋白質等大分子較好地被降解利用，使得與之結合的酚類物質被釋放出來，可溶性酚類物質含量升高[23-24]。據段希寧等[25]的研究，總酚含量維持在較高水平的另一點原因可能是乳酸菌在發酵過程中產生的有機酸能防止酚類物質的降解從而導致總酚含量的增加。此次試驗中干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復配發酵組以及3種乳酸菌共同發酵組的總酚含量有所下降，推測原因可能是發酵過程中乳酸菌的生物降解作用或是產生多種酶系水解營養物質，促使多酚物質發生不同程度的水解或聚合，此外發酵樣品中存在溶解氧也會導致酚類化合物的氧化[26]。

圖3 不同乳酸菌發酵對菠蘿漿總酚含量的影響Fig.3 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on total phenol content of pineapple pulp

2.4 菠蘿漿發酵后DPPH自由基清除能力的變化

由圖4可知，菠蘿漿未發酵組的Trolox等效抗氧化能力為5.08 μmol TE/g，加乳酸菌發酵24 h后3種乳酸菌共同發酵組的抗氧化能力顯著低于植物乳桿菌單獨發酵組（P＜0.05），為4.91 μmol TE/g，植物乳桿菌單獨發酵表現最佳，抗氧化能力達到5.37 μmol TE/g，其次為腸膜狀明串珠菌單獨發酵組，為5.25 μmol TE/g，干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復配發酵組也能達到5.19 μmol TE/g，說明了乳酸菌發酵有利于提高菠蘿漿DPPH自由基清除能力。相關研究表明[28-31]，自由基清除能力與酚類物質含量具有正相關性，發酵后菠蘿漿總酚含量處于較高水平有助于增強其抗氧化活性，這可能是由于酚類物質提供了氫離子，并通過共振雜化而達到穩定，從而導致DPPH自由基清除能力升高[32]。

圖4 不同乳酸菌發酵對菠蘿漿DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on DPPH free radical scavenging ability of pineapple pulp

2.5 菠蘿漿發酵后維生素C含量的變化

由圖5可知，未發酵組的維生素C含量為4.44 mg/g，腸膜狀明串珠菌單獨發酵組的維生素C含量為4.73 mg/g，而其他發酵組的維生素C含量均顯著下降（P＜0.05）。其中干酪乳桿菌單獨發酵組、植物乳桿菌單獨發酵組以及植物乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復配發酵組，維生素C含量分別降至3.43 mg/g、2.83 mg/g和2.83 mg/g。維生素C含量的減少可能是維生素C自身不穩定，極易氧化分解，加之在發酵過程中可能作為碳源被乳酸菌代謝利用，在凍干制粉貯藏過程中也會造成一定損失[33]。此次試驗中腸膜狀明串珠菌單獨發酵菠蘿漿使維生素C含量保持在高水平，推測原因可能是腸膜狀明串珠菌產乳酸和苯乳酸的能力較強[34]，有機酸的積累使樣品內部呈現酸性環境，而維生素C在酸性環境下較為穩定。

圖5 不同乳酸菌發酵對菠蘿漿維生素C含量的影響Fig.5 Effects of different lactic acid bacteria fermentation on vitamin C content in pineapple pulp

2.6 菠蘿漿發酵后揮發性物質的變化

菠蘿漿經乳酸菌發酵后檢測出的揮發性物質成分如表1所示。

由表1可知，8組樣品分別鑒別出23、29、28、24、19、23、30、22種成分，在所有樣品中，酯類化合物的數量和含量在所有揮發性成分中均最高，共檢出17種酯類，含量最多的是3-甲硫基丙酸甲酯、3-甲硫基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸甲酯。其次是醛酮類和醇類，分別檢出12種和11種，醛酮類物質主要是2-庚酮、2-壬酮和β-環檸檬醛，醇類物質以正辛醇、2-庚醇和異戊醇為主，酸類的含量相對較少。未發酵的菠蘿漿檢測出的酯類成分占總揮發性物質50%以上，主要為2-甲基丁酸甲酯（27.96%）、3-甲硫基丙酸甲酯（21.31%）和己酸甲酯（10.71%），張峻松等[35]研究菠蘿揮發性組分也發現酯類最多（15種），與本實驗結果大致相符，說明菠蘿的主要芳香物質是酯類。由表1亦可知，菠蘿漿經過不同乳酸菌發酵后部分酯類含量有所下降，但揮發性物質的總數量有明顯的增加，主要表現在增加了醇類和醛酮的數量，其中使用干酪乳酸菌和植物乳桿菌單獨發酵的菠蘿漿酯類、醇類和酚類等各物質的數量和含量均處在較高水平。植物乳桿菌單獨發酵組的醇類、醛酮類、酚類和烴類分別增加了2、1、1和2種。菠蘿漿經干酪乳酸菌單獨發酵后增加了異戊醇（14.35%），而2-甲基丁酸甲酯的含量由原本的27.96%降至14.01%。

表1 菠蘿樣品中主要揮發性物質GC-MS測定結果Table 1 Determination results of main volatile substances in pineapple samples by GC-MS

續表

3 結論

添加乳酸菌發酵有利于維持菠蘿漿的酶活性和抗氧化能力，發酵后的菠蘿漿芳香成分有所增加。乳酸菌單一發酵效果要好于復配發酵，其中干酪乳桿菌單獨發酵可使菠蘿漿的SOD酶活保持在97.70 U/g，總酚含量達到最高（0.51 mg GAE/g），對凍干成粉后維生素C的保護作用也較可觀；植物乳桿菌單獨發酵菠蘿漿時蛋白酶活性最好（821.00 U/mL），同時其DPPH自由基清除能力最高，達到5.37 μmol TE/g；腸膜狀明串珠菌單獨發酵組的維生素C含量最高，達到4.73 mg/g；菠蘿漿經干酪乳酸菌和植物乳桿菌單獨發酵后，酯類、醇類和酚類等各物質的數量和含量均處在較高水平，鑒定出的揮發性成分分別達到29和28種。綜上，將菠蘿果肉進行打漿處理后，選擇干酪乳桿菌或植物乳桿菌單獨發酵能獲得較好的品質，可為菠蘿加工以及開發相關菠蘿乳酸菌發酵產品提供一定的參考。