醬香型酒糟發酵前后品質和揮發性成分初步分析

黃 武，王曉丹，邱樹毅，曹文濤，周鴻翔，羅小葉，班世棟*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

醬香型白酒生產過程中會產生大量酒糟，其主要是由高粱、小麥和稻殼等廢棄固形物組成。酒糟中含有豐富的營養成分[1]，常用于制備動物飼料[2-3]和肥料[4-5]。微生物發酵處理是用于改善酒糟品質生產飼料和有機肥的有效手段，在發酵過程中，微生物可以產生一些復雜的酶系，從而改善酒糟的品質，其主要有單菌種發酵[6]和復合菌種發酵[7]技術。目前報道的關于醬香型酒糟的研究主要是在動物飼料、食用菌栽培和功能性微生物篩選分離等方面的應用。鄭應家等[8]在荷斯坦奶牛日糧中添加發酵后的醬香型酒糟，結果表明此舉可以提高飼料的利用率，提升奶牛的產奶量，延長泌乳周期。陸承云等[9]研究了醬香型酒糟栽培姬松茸的效果，結果表明醬香型酒糟可以用于姬松茸的栽培，但應控制酒糟的添加量。白成松等[10-11]從醬香型酒糟中篩選到了對酒糟纖維素有一定降解效果的高溫放線菌和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），在酒糟綜合利用方面具有一定的潛力。關于醬香型酒糟來源的功能性微生物改善醬香型酒糟品質和揮發性成分影響的報道較少。

庫德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齒菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）是從醬香型酒糟和大曲中篩選分離出的兩株產香菌，其對酒糟微環境的耐受能力有明顯優勢，并且能夠產生多種纖維素酶，在酒糟纖維素降解方面具有一定的潛力。本試驗利用兩株優良菌種對廢棄酒糟進行固態發酵處理，通過測定酒糟的微生物指標、理化指標和揮發性成分，探究兩株優良菌種對酒糟品質的改善效果和揮發性成分的影響，以期為后期醬香型酒糟發酵工藝優化處理提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

酒糟取自茅臺鎮醬香型白酒酒廠粹沙酒糟；庫德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齒菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）為實驗室從醬香型酒糟和醬香大曲中分離的產香功能菌，均由貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室保存；植物金屬硫蛋白酶聯免疫分析試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、pH自然。以不加瓊脂的培養基制成PDA液體培養基。

麩皮培養基：15 g麩皮裝于50 mL搖瓶中，加入15 mL蒸餾水，攪拌均勻后于121 ℃下滅菌20 min。

營養瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Thermo CR3i多功能冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技公司；HP 7890/5975C氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀：美國安捷倫公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母種子液

將畢赤酵母（FBKL2.0008）接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次，再接種到100 mL PDA液體培養基中，在30 ℃條件下培養1 d制成酵母種子液，用于酒糟發酵。

1.3.2 白耙齒菌擴大培養

將白耙齒菌（FBKL3.0021）接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次，再接種到PDA斜面中，30 ℃生長7 d，加入5 mL生理鹽水，用接種環刮下培養基上菌絲，混勻，取1 mL接種到麩皮培養基中，攪拌均勻，在30 ℃條件下培養3 d，制成擴大培養基。

1.3.3 醬香型酒糟微生物指標測定

對粹沙酒糟的細菌、霉菌和酵母數量分別計數，細菌用營養瓊脂培養基計數，酵母和霉菌用PDA培養基計數。

1.3.4 醬香型酒糟部分理化指標的測定

酒糟中水分、淀粉和還原糖含量測定參考T/CBJ 004—2018《固態發酵酒醅通用分析方法》；粗纖維的含量參考GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測定方法》中的過濾法測定[13]；粗蛋白的測定參考GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》中的凱氏定氮法[14]；粗脂肪含量的測定參考GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》[15]；粗灰分含量的測定參考GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》[16]；多糖含量測定參考董鈺明等[17]的方法。無氮浸出物計算公式如下：

無氮浸出物（%）=100%-（水分%+粗蛋白%+粗脂肪%+粗纖維%+粗灰分%）

1.3.5 醬香型酒糟金屬硫蛋白含量的測定

金屬硫蛋白的提?。喝⊙心ゾ圃? g，加入10 mL 0.1 mol pH8.6的Tris-HCl緩沖液，用電動玻璃勻漿器在冰浴條件下充分攪拌，勻漿液放于4 ℃，浸提5～8 h后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min；收集上清液，并于100 ℃水浴加熱5 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液中加入3倍體積無水乙醇于-20 ℃過夜；取沉淀，加入2 mL 0.01 mol/L Tris-HCI緩沖液室溫溶解4 h，然后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清，此即為金屬硫蛋白粗提取液。根據植物金屬硫蛋白酶聯免疫分析試劑盒操作說明測定樣品中金屬硫蛋白含量。以上理化指標均平行測定3次，結果取平均值。

1.3.6 醬香型酒糟揮發性成分測定

取酒糟樣品約5 g，置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭的手動進樣器，在50 ℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解析3 min進樣。

色譜柱為ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫40 ℃（保留2 min），以4 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間：1.5 min；離子源為電子電離源（electron ionization，EI）；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 428 V；接口溫度280 ℃；質量范圍20～450 amu。

對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley275標準質譜圖，確定了揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對含量。

1.3.7 菌株發酵

酵母發酵：在前期預試驗的基礎上，選擇錐形瓶薄膜封口方式進行發酵。稱取100 g酒糟，調節pH5～6，接種酵母10%（V/V），發酵時間為7 d，發酵溫度為28 ℃。

白耙齒菌發酵：在前期預試驗的基礎上，選擇錐形瓶薄膜封口方式進行發酵。稱取20 g酒糟（在60 ℃下烘干10 h），加20 mL蒸餾水，調節pH5～6，按體積分數10%接種白耙齒菌擴大培養基，發酵時間為7 d，發酵溫度為30 ℃。

發酵結束后，測定酒糟的微生物指標、理化指標和揮發性成分。

2 結果與分析

2.1 醬香型酒糟微生物指標計數結果

酒糟發酵前后微生物計數結果見表1。由表1可知，原酒糟中主要的微生物為細菌屬，未檢測出酵母和霉菌，經酵母和白耙齒菌發酵后，各項微生物指標的數量均顯著增加。其中，酵母組中共檢測出細菌1.68×107CFU/g和酵母6.00×107CFU/g；白耙齒菌組共檢測出細菌、酵母和霉菌三種微生物，其數量分別為2.10×106CFU/g、7.90×105CFU/g和3.00×103CFU/g。

表1 酒糟發酵前后微生物計數結果Table 1 Microbe count results of distiller's grains before and after fermentation

由微生物指標計數結果可知原酒糟中微生物種類較為單一，其原因可能是因為醬香型酒糟中pH值較低[18]，微生物如霉菌等無法在這種極端pH值環境中生長；其次，本試驗所用的畢赤酵母和白耙齒菌均能利用醬香型酒糟進行生長和代謝，且白耙齒菌對酒糟的利用程度優于酵母。

2.2 醬香型酒糟部分理化指標測定結果

由圖1可知，原酒糟中水分含量達65.19 g/100 g，發酵后，其水分含量的變化較小，其中，酵母組的水分含量為62.93 g/100 g，白耙齒菌組的水分含量為59.43 g/100 g。

圖1 醬香型酒糟部分理化指標測定結果Fig.1 Determination results of part physicochemical indexes of sauce-flavor distiller's grains

原酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、無氮浸出物和淀粉的含量分別為8.42 g/100 g、2.90 g/100 g、4.18 g/100 g、3.24 g/100 g、16.07 g/100 g和13.67 g/100 g。經酵母菌發酵后，酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量均有所下降，其中淀粉含量為9.19 g/100 g，下降了32.77%，粗脂肪、粗纖維和粗灰分下降幅度較小，分別為2.68 g/100 g、3.95 g/100 g和2.78 g/100 g；而酒糟中粗蛋白和無氮浸出物的含量有所上升，分別為8.7 g/100 g和18.96 g/100 g。白耙齒菌組酒糟成分的變化程度最大，酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量下降明顯，分別為0.61 g/100 g、2.76 g/100 g、2.08 g/100 g和5.17 g/100 g，與原酒糟相比，白耙齒菌組酒糟的粗脂肪和淀粉含量分別下降78.97%和62.18%；粗蛋白和無氮浸出物的含量分別上升了10.69%和60.55%，達到9.32 g/100 g和25.8 g/100 g。

原酒糟中多糖、還原糖和金屬硫蛋白的含量分別為520.00mg/100g、200.00mg/100g和5.80mg/100g，白耙齒菌組酒糟的多糖、還原糖含量均比原酒糟低，分別為86.41mg/100 g、62.50 mg/100 g，金屬硫蛋白含量變化不大，為5.90 mg/100 g而酵母組中多糖含量為630.00 mg/100 g，上升21.15%，但還原糖含量卻下降至140.00 mg/100 g，金屬硫蛋白含量上升至6.80 mg/100 g。

在醬香型白酒生產過程中，控制原料的適宜參數，如水分、粗蛋白和淀粉含量等是生產過程中的關鍵點之一。本試驗所用的粹沙酒糟與茅臺酒糟[19]相比，除水分含量和無氮浸出物含量稍高，其余理化指標均低于茅臺酒糟，其原因可能是發酵原料種類、配比和生產工藝的不同，造成固態發酵白酒酒糟的營養物質種類和含量的差異[1]。金屬硫蛋白是微生物與動植物產生的金屬結合蛋白[20]，其在保健品和化妝品領域的應用前景廣泛，因此在研究開發酒糟丟糟產品用于生產保健品時，企業要求將此項指標考慮在內。本試驗中酵母組的金屬硫蛋白含量有所上升，其原因可能是酵母組中細菌和酵母的生物量遠高于其余兩組，而在本試驗中金屬硫蛋白主要來源于微生物，因此推測金屬硫蛋白含量的升高可能與酵母組中的生物量有關，但確切的原因還需進一步研究。綜上所述，試驗中所用畢赤酵母和白耙齒菌均能夠改善酒糟的品質，但兩者之間也存在差異，這與游玲等[21]的研究結果一致。白耙齒菌對酒糟品質的改善效果優于畢赤酵母，但金屬硫蛋白含量低于畢赤酵母組，因此，在后續醬香型酒糟產品開發時可以考慮將兩者結合，進行混菌發酵。

2.3 醬香型酒糟揮發性成分含量測定結果

由表2可知，原酒糟中共檢出54種揮發性成分，其中酯類29種、醛類8種、醇類6種、酸類3種、酚類和酮類各1種、烷類和其他類各2種；構成原酒糟中揮發性成分的物質主要是酯類（47.3%）、醇類（27.7%）和酸類（13.4%）。酵母組中揮發性成分共檢出44種，其中酯類28種、醛類7種、醇類6種、酚類、酸類和其他類各1種；構成其揮發性成分主體物質是酯類（57.9%）和醇類（30.9%）。白耙齒菌組共檢出37種揮發性成分，其中烯類23種、醛類6種、醇類3種、酮類2種、酯類和酚類各1種；其揮發性成分主體物質是烯類（48.7%）、其他類（22.1%）和酮類（13.1%）。

表2 酒糟發酵前后揮發性成分相對含量Table 2 Relative contents of volatile components in distiller's grains before and after fermentation%

續表

續表

發酵后的酒糟中揮發性成分的種類和含量各不相同，其中原酒糟中揮發性成分最多，酵母組次之，白耙齒菌組中最少。并且各試驗組中揮發性成分主體物質也存在一定差異，原酒糟和酵母組中揮發性成分主體物質均含有酯類和醇類，在檢出的酯類物質中，乙酯類含量和種類最多，可能與酵母種類和酶活相關[22]，這與王軒等[23]的結果一致。而白耙齒菌組的揮發性成分主體為烯類，這與楊建遠等[24]的結果不一致，后者揮發性主體物質為酯類（42.41%），但兩者都具有濃郁的香氣，這可能是因為兩者所用原料不同所致。白耙齒菌組的揮發性成分雖然比酵母組少，但其揮發性成分主要為烯類物質，其中含量較大的有（-）-馬兜鈴烯（10.64%）、α-愈創木烯（9.38%）和（+）-苜蓿烯（8.17%）等，萜烯類物質普遍具有較強的抗菌活性、止痛能力和抗氧化活性等功能[25]，說明白耙齒菌發酵后的酒糟更具應用價值，更適合用于醬香型酒糟產品的開發。

3 結論

本研究結果表明，白耙齒菌組微生物的種類和數量最多，共檢測出細菌、酵母和霉菌三種微生物，酵母組次之，但未檢出霉菌，原酒糟中最少，只檢出細菌；白耙齒菌和酵母均能利用酒糟的營養成分進行生長和代謝，且前者對于酒糟的利用程度優于后者，兩株菌均能在一定程度上改善酒糟的品質；原酒糟、酵母組和白耙齒菌組分別檢測出54種、44種和37種揮發性成分，且相對含量逐漸減少，原酒糟和酵母組的主要揮發性成分是酯類和醇類，而白耙齒菌組的揮發性成分主要是烯類?；诰圃闫焚|改善效果和揮發性成分測定結果，建議在后續醬香型酒糟發酵處理時，采用兩者結合進行混菌發酵。本研究為后續發酵工藝優化處理提供了數據支撐。