嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草幼苗生長和抗氧化防御系統的影響

劉 鵬，崔彤彤，孫鵬越，周 雨，張智偉，尉欣榮，呼天明，付娟娟

（西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100）

草坪是園林綠化和城市生態文明建設的重要景觀元素。然而，隨著城市化不斷推進和生態文明建設的加強，高大喬木、灌木及高樓大廈等引起的遮陰環境影響草坪草的正常生長。

前人研究報道，由于高大喬木和樓宇的遮擋，我國一半以上的草坪生長在遮陰環境中[1]。遮陰脅迫改變了草坪的小氣候環境，使草坪草在形態結構和生理代謝等方面發生變化，導致草坪的坪用性狀和抗逆能力下降[2-4]。因此，研究草坪植物的遮陰逆境適應機制，提高草坪草的耐陰能力，是草坪研究及從業人員亟需解決的瓶頸問題。

目前，對環境友好的和可持續發展的草坪養護管理措施越來越受歡迎和重視。其中，利用接種植物生長促生菌這一生物治理方法來提高植物抗逆能力已經成為學者們的關注焦點。通過對植物–根際促生菌互作的研究發現，根際促生菌不僅可以促進植物生長、增加作物產量，而且還可以提高植物對生物和非生物的脅迫耐受能力，如病蟲害、干旱、重金屬污染等[5-8]。其中，節細菌屬(Arthrobacter)根際促生菌能夠提高植物對非生物脅迫抗性[9-11]。最新研究發現，節細菌屬的幾個菌種如Arthrobacter nitroguajacolicus 和Arthrobacter woluwensis AK1 能夠誘導類黃酮類物質的合成及鹽脅迫相關基因LAX3 和ST1 的表達，從而緩解鹽脅迫對植物的傷害[12-13]。然而，關于節細菌屬根際促生菌對草坪草耐陰性的研究鮮有報道。

牧草種質資源與逆境課題組前期通過比較耐陰性強的麥冬(Ophiopogon japonicus)和耐陰性較弱的多年生黑麥草(Lolium perenne)的根際土壤微生物組成和多樣性，研究表明嗜冷乳糖節桿菌B7(Arthrobacter psychrolactophilus)菌株在麥冬根際土壤中相對豐度較高，達22.5%。然而，嗜冷乳糖節桿菌B7 對草坪草遮陰脅迫響應的調控機制尚不明晰。基于此，對多年生黑麥草根系接種嗜冷乳糖節桿菌B7，探討在遮陰脅迫下其調節多年生黑麥草的生理機制，旨在為從根際土壤微生物與植物互作角度出發揭示植物耐陰機理，以及為生產實踐中利用根際促生菌提高草坪草的耐陰能力提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

多年生黑麥草品種為博士(Lolium perenne ‘Ph.D.’)，由西北農林科技大學草地工程實驗室提供。供試嗜冷乳糖節桿菌B7 菌株購買于中國微生物菌種保藏中心(http://www.biobw.org/)。

1.2 幼苗培養與處理

試驗于2017 年9 月 ? 11 月于西北農林科技大學進行。多年生黑麥草種子經次氯酸鈉消毒后，用滅菌水清洗3～4 次，播種在盛有滅菌的石英砂的一次性塑料培養缽(直徑15 cm)中，在植物培養室內培養，光照強度為11 000 lx，光期/暗期：16 h/8 h，溫度(23 ± 2) ℃/(20 ± 2) ℃，相對濕度65%/60%。每盆定植6 株幼苗，每隔2 d 澆灌一次滅菌的Hoagland營養液。在培養3 個星期后，進行根際接種B7 和遮陰處理。遮陰處理采用的是遮陰網和日光燈，遮陰梯度為0、20%、40%、60%和80% [用便攜式光量子測定儀(上海，STB-02)測定光照強度]，每個處理設置3 次生物學重復。對照組生長在正常光照條件。

1.2.1 嗜冷乳糖節桿菌B7 菌株復活培養及菌懸液制備

凍干菌株于超凈臺中打開，接種至營養肉汁斜面培養基(蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 m L，牛肉提取物3 g，瓊脂15 g；pH 7.0)進行復活培養48 h。挑取單克隆于上述液體培養基中，在25 ℃恒溫搖床中培養48 h，轉速為200 r·m in?1。之后將1 m L 菌懸液重新接種至200 m L 液體培養基中過夜培養，制備成108cfu·m L?1的菌懸液。

1.2.2 接種與遮陰處理

輕輕剝開表層基質，取5 m L 上述菌懸液接種到供試植株根系周圍，接種2 周后進行遮陰處理。遮陰處理4 周后，用滅菌的剪刀剪取葉片，將樣品置于液氮中固定30 m in 后，儲存在?80 ℃冰箱待后續測定使用。

1.3 測定項目及方法

每個處理隨機選取5 株幼苗，測量從莖基部到葉尖的垂直高度，記為株高；從莖基部剪掉地上部枝條，用萬分之一天平稱量其鮮重；參考李合生[14]中方法測定葉片的相對電導率和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性和H2O2含量采用Veljovic-Jovanovic 等方法[15]；采用Elstner 和Heupel 方法測定超氧陰離子自由基(積累[16]；采用Cakmak 和Marschner 方法對抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)進行測定[17]；采用Foyer和Halliwell 方法對還原性谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)含量進行測定[18]。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0 軟件對不同遮陰強度和B7 處理的數據進行雙因素方差分析，F 檢驗顯著時用Duncan 法對生物量、株高、電導率、丙二醛、活性氧、抗氧化防御系統相關指標進行多重比較(P ＜0.05)。采用Sigma plot 14.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 遮陰脅迫下接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對多年生黑麥草幼苗生長的影響

遮陰不同程度地抑制了多年生黑麥草幼苗的生長(圖1)。隨著遮陰強度的增加，其對多年生黑麥草的抑制作用增強，其中以60%和80%遮陰脅迫的抑制作用最顯著(P ＜ 0.05)。接種B7 能夠有效地緩解遮陰脅迫對多年生黑麥草幼苗生長的抑制(圖1A、B)。與未接種B7 相比，在40%、60%和80%遮陰脅迫下接種B7，多年生黑麥草的地上部分生物量和株高分別增加19.42%、21.70%、27.34%和2.68%、4.91%、12.17% (圖1)。這一研究結果表明接種嗜冷乳糖節桿菌B7 減輕了遮陰脅迫對多年生黑麥草的生長抑制。

2.2 遮陰脅迫下接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對多年生黑麥草細胞膜穩定性的影響

遮陰脅迫導致多年生黑麥草葉片中相對電導率和細胞膜脂過氧化產物丙二醛含量發生明顯改變(圖2)。20%和40%遮陰對多年生黑麥草相對電導率無顯著影響(P ＞ 0.05)。未接種B7時，60%和80%遮陰脅迫下，其相對電導率和丙二醛含量分別較無遮陰增加 272.41%、369.70%和145.55%、119.23%。接種B7 能夠顯著降低重度遮陰(60%和80%遮陰)下多年生黑麥草的相對電導率和丙二醛的積累(P ＜0.05)，與60%和80%遮陰脅迫相比，B7+60%遮陰和B7+80%遮陰處理中相對電導率和丙二醛含量分別顯著降低65.67%、64.77%和 57.10%、50.50% (P ＜0.05)。然而，在20%和40%遮陰脅迫下接種B7 并未對細胞膜產生顯著的保護作用(P ＞ 0.05)。

2.3 遮陰脅迫下接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對多年生黑麥草葉片中H2O2 和 含量的影響

隨遮陰強度增加，活性氧的積累表現為逐漸增加的趨勢(圖3)。與未接種B7 相比，20%和40%遮陰對多年生黑麥草葉片中H2O2和含量的影響不顯著(P ＞ 0.05)，而60%和80%遮陰脅迫較無遮陰，H2O2和的積累顯著增加(P ＜ 0.05)。接種B7 能夠有效降低遮陰脅迫誘導的活性氧的積累，與單獨遮陰處理相比，20%、40%、60%和80%遮陰脅迫下接種B7 使得H2O2和含量分別下降5.88%、24.41%、33.60%、40.00%和30.91%、22.94%、25.67%、49.37%。這表明遮陰脅迫下接種B7 有效減輕了多年生黑麥草葉片由于活性氧大量積累而引發的氧化傷害。

圖 1 嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草幼苗生長的影響Figure 1 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on p lant grow th of perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

圖 2 嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草葉片中細胞膜損傷的影響Figure 2 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on cell membrane damage in perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

2.4 接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草葉片中抗氧化酶活性的影響

圖 3 嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草葉片中活性氧積累的影響Figure 3 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on reactive oxygen species (ROS)levels in perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

圖 4 接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草葉片中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽轉移酶(GR)活性的影響Figure 4 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on the activities of superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), and glutathione reductase (GR) in leaves of perennial ryegrass under shade stress

如圖4 所示，遮陰脅迫對抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX 和GR 活性產生不同程度的影響。遮陰脅迫下SOD 活性表現為先增加后降低的趨勢，其中80%遮陰顯著降低SOD 活性(P ＜ 0.05)，而B7 處理能夠增加80%遮陰脅迫下SOD 活性。POD 活性與SOD 活性呈相反變化趨勢，表現為隨著遮陰強度的增加先降低后增加，在60%遮陰處理下POD 活性顯著增加(P ＜ 0.05)；接種B7 對40%遮陰脅迫下POD 活性的影響不顯著(P ＞ 0.05)，但能夠顯著提高80%遮陰脅迫下POD 活性(P ＜ 0.05) 。CAT 活性隨遮陰強度的增加而下降，與對照相比，在80%遮陰強度下CAT 活性顯著下降43.16% (P ＜ 0.05)；而B7 處理能夠顯著提高80%遮陰脅迫下CAT 活性(P ＜ 0.05)，20%遮陰脅迫對CAT 活性的影響未達到顯著差異(P ＞ 0.05)。80%遮陰脅迫下接種B7 導致CAT 活性與其單獨遮陰處理相比增加78.33%(P ＜0.05) 。與無遮陰相比，APX 活性在20%和40%遮陰脅迫下逐漸增加，而在60%和80%遮陰脅迫下則顯著降低(P ＜ 0.05)。在20%～80%遮陰脅迫下，接種B7 能夠有效提高APX 活性。與單獨遮陰處理相比，在20%、40%、60%和80%遮陰脅迫下接種B7 導致APX 活性依次增加36.27%、17.59%、205%和200%。與之相似，GR 活性在20%和40%遮陰脅迫下呈現增加趨勢，而在60%和80%遮陰脅迫下則呈下降趨勢，而且遮陰脅迫下接種B7 能夠顯著地提高GR 活性(P ＜ 0.05)。

圖 5 接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對遮陰脅迫下多年生黑麥草葉片中抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影響Figure 5 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on ascorbic acid (AsA) and glutathonine (GSH) contents in leaves of perennial ryegrass under shade stress

2.5 遮陰脅迫下接種嗜冷乳糖節桿菌B7 對多年生黑麥草葉片中AsA 和GSH 含量的影響

20%和40%遮陰對多年生黑麥草葉片中AsA含量的影響較小，而與無遮陰相比，60%和80%遮陰脅迫下AsA 含量分別顯著增加117.28%和72.19%(P ＜ 0.05)。接種B7 能夠顯著提高多年生黑麥草中AsA 含量(P ＜ 0.05)，與單獨遮陰相比，接種B7 后20%、40%、60%和80%遮陰AsA 含量依次增加136.99%、117.49%、30.22%和37.29%(圖5)。除了40%遮陰外，20%、60%和80%遮陰均能夠顯著提高多年生黑麥草葉片中GSH 含量(P ＜ 0.05) 。與單獨遮陰脅迫處理相比，40%、60%和80%遮陰下接種B7 能夠顯著提高其GSH 含量(P ＜ 0.05)。

3 討論與結論

喬、灌、草三者相結合的方式常被應運于城市和園林綠化[19]，導致草坪草常處于遮陰逆境中。由高大樹木、灌木或建筑物引起的光照不足往往會使草坪草生長瘦弱，對生物與非生物逆境的抗性也隨之下降。從而使草坪坪用性質降低[20-21]。研究表明，節細菌屬根際促生菌被廣泛應用于提高植物對非生物脅迫的抗性[9-13]，比如節細菌屬Arthrobacter nitroguajacolicus 和Arthrobacter woluwensis AK1 能夠誘導類黃酮類物質的合成及鹽脅迫相關基因的表達，從而提高植物對非生物脅迫的抗性[12-13]。嗜冷乳糖節桿菌能合成β-半乳糖苷酶[21]，然而關于嗜冷乳糖節桿菌調控植物非生物脅迫抗性的研究未見報道。本研究發現，遮陰脅迫抑制多年生黑麥草的生長，而接種節細菌屬嗜冷乳糖節桿菌B7 菌株能夠有效緩解遮陰脅迫對多年生黑麥草生長的抑制。這表明嗜冷乳糖節桿菌B7 能夠保護植物免受遮陰脅迫的傷害。這與Khan 等[12]和Safdarian 等[13]研究結果相一致，節細菌屬根際促生菌可以提高植物的耐鹽能力。

遮陰脅迫與其他非生物脅迫類似，均可誘導植物細胞內活性氧大量積累，從而引發植物體內發生嚴重的氧化脅迫，導致細胞膜系統受到嚴重的氧化損傷[22]。因此，逆境條件下相對電導率、膜脂過氧化產物丙二醛和活性氧的積累水平是植物受脅迫損傷的重要體現。本研究結果表明，60%和80%遮陰脅迫導致多年生黑麥草葉片中相對電導率增加及積累較多的丙二醛和活性氧，而接種B7 能夠顯著降低相對電導率、丙二醛、H2O2和的含量。這表明B7 能夠減輕遮陰脅迫對植物造成的氧化損傷，從而提高植物的耐陰能力。

已有研究發現，植物體內抗氧化酶和非酶抗氧化體系在活性氧平衡方面具有重要作用[23]。在植物的氧化防御過程中，SOD 作為解毒活性氧的第1 個關鍵酶，具有將歧化為H2O2和O2的功能，CAT、POD 及抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環可以進一步清除大量積累的H2O2[24]。本研究結果表明，在一定程度的遮陰脅迫下，接種B7 激活了SOD、POD、CAT、APX、GR 活性，并提高了AsA 和GSH 含量。這表明嗜冷乳糖節桿菌B7 通過提高AsA-GSH 循環效率，誘導多種抗氧化酶活性增加，減輕由于活性氧過量積累而造成的氧化還原失衡。類似的研究指出，接種根際促生菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium)能夠提高植物的抗旱性，與其誘導幾種抗氧化酶如SOD、POD、CAT 和APX 活性增強有關[25]。與之相似，Park 等[26]也強調接種植物根際促生菌能夠激活多種抗氧化酶的活性，及時地清除過量積累的活性氧，從而提高植物對環境脅迫的適應性。

綜上所述，接種節細菌屬嗜冷乳糖節桿菌B7能夠增強多年生黑麥草的耐陰性，其作用機制主要歸因于提高遮陰脅迫下多年生黑麥草的抗氧化系統活性及促進AsA-GSH 循環，從而增加活性氧的清除能力，減輕遮陰引起的氧化損傷。