不同分級指數苜蓿干草–小麥秸稈組合對牦牛瘤胃體外發酵的影響

夏洪澤，郝文君，崔占鴻，劉書杰

（青海大學畜牧獸醫科學院 / 青海省牦牛工程技術研究中心 / 青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，青海 西寧 810016）

牦牛作為青藏高原地區的特有畜種，以放牧養殖為主，但由于青藏高原地區的冷季時間較長，高寒草地牧草產量較低，營養價值變化較大，不能滿足該地區冷季反芻家畜自身的營養需要量，致使家畜體重明顯降低甚至死亡。近年，牦牛養殖已由全年放牧飼養調整到適度規模舍飼飼養，科學合理地進行牦牛的營養平衡補飼已勢在必行[1-5]。

在家畜舍飼養殖過程中，農作物秸稈作為粗飼料已被廣泛應用于牦牛的生產，在青海地區小麥秸稈產量巨大，年產量達到46 萬t[6]，為充分發揮并利用當地的飼草料資源優勢，將小麥(Triticum aestivum)秸稈與苜蓿(Medicago)干草組合，發揮粗飼料間的正組合效應，從而將小麥秸稈與苜蓿干草更好地應用于生產[7-9]。

在粗飼料品質評定上，已有很多體系，如營養值指數體系(NVI)、可消化能進食量體系(DEI)、飼料的相對值體系(RFV)等。2001 年盧德勛根據我國的飼草產量以及供給現狀，首先提出飼草分級指數(GI) 的概念[10]。之后經過 GI 理論驗證、GI 模型化研究以及補充，逐步趨于理論完善和技術成熟，并在篩選和優化飼草組合等方面得到了廣泛的應用[11-14]。

國內外大量研究表明，多種粗飼料進行搭配具有協同作用，可以有效改善瘤胃的內環境，提高飼料的消化利用率[10]。因此本研究以西北地區常用飼草苜蓿干草、小麥秸稈為研究對象，采用體外產氣法探究兩種粗飼料組合降解率、瘤胃發酵的變化趨勢，篩選出最佳分級指數的苜蓿干草–小麥秸稈組合，為發揮青藏高原地區飼草資源優勢和提高該地區舍飼牦牛的生產性能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品的采集與處理

1.1.1 牧草采集與處理

苜蓿干草、小麥秸稈經65 ℃干燥制成風干樣，粉碎后過孔徑為0.85 mm 的篩子，自封袋密封保存待測，苜蓿干草、小麥秸稈原樣營養水平如表1 所列。

1.1.2 試驗動物及其日糧營養水平

本試驗的瘤胃液供體為3 頭裝有瘤胃瘺管、體重為(280.5 ± 15.0) kg 的大通牦牛，飼喂方式為自由采食、飲水，每日飼喂2 次。飼喂日糧的成分和營養組成如表2。

1.2 試驗設計

5 種苜蓿干草–小麥秸稈組合的GI 分別為7.03、6.21、5.38、4.55 和3.72，即苜蓿干草與小麥秸稈比例分別為70 ? 30、60 ? 40、50 ? 50、40 ? 60 和30 ? 70，每個組合設定3 個重復，利用體外產氣法進行試驗，累積發酵48 h。

表 1 小麥秸稈、苜蓿干草的營養水平Table 1 Nutrient levels of wheat straw and alfalfa hay

表 2 日糧成分和營養組成Table 2 Diet composition and nutritional composition

1.3 樣品處理方法

1.3.1 苜蓿干草、小麥秸稈及其組合分級指數的計算

分級指數、代謝能(ME)及采食量(VDM I)預測模型參考胡紅蓮和盧媛[15]的計算公式：

苜蓿干草–小麥秸稈組合GI = 苜蓿干草GI × 相應比例 + 小麥秸稈GI × 相應比例。式中：CP 為粗蛋白，VDM I 為單日干物質采食量，ME 為代謝能，NDF 為中性洗滌纖維，ADF 為酸性洗滌纖維含量，BW 為試驗動物體重。

1.3.2 樣本制備及瘤胃液的配置

稱取組合樣品(400 ± 5) mg 裝入自制的尼龍袋，待用。將裝好樣品的尼龍袋放入100 m L 的發酵管內，為保證發酵管氣密性，在其內塞上均勻涂抹適量工業凡士林，每個樣本設定3 個重復，每次試驗做3 個空白對照。

采用Menke 的方法準備人工瘤胃營養液[16]，晨飼前，通過瘤胃瘺管，每頭牦牛各抽取1 000 m L 瘤胃液，充分混勻后，在通入CO2的前提下，將人工瘤胃液與瘤胃營養液以2 ? 1 的體積比混合；每個培養管加入(40.0 ± 0.5) m L 混合營養液。排空培養管內全部氣體，并記錄起始刻度值，立即轉入人工培養箱(39 ℃)。

1.3.3 發酵底物、發酵液的收集

分別在發酵3、6、12、24 和48 h 時，將培養管取出，取出裝有發酵底物的尼龍袋，投入冰水中以終止反應，并用蒸餾水沖洗尼龍袋，直至無色，終止其發酵，65 ℃烘干，備用；將發酵液收集在15 m L 離心管中，放?20 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 體外發酵指標測定

1.4.1 累積產氣量測定及產氣參數測定

參照夏洪澤等的累積產氣量(GP)測定方法[17]，分別在發酵0、3、6、12、24 和48 h 取出培養管并記錄刻度值；利用SAS 9.0 軟件，根據?rskov 和M cdonald[18]的產氣模型GP = b (l ? e?ct)，計算出各體外產氣參數。產氣模型中，b 代表潛在產氣量(m L)；t 代表發酵開始后某一時間(h)；c 代表b 的產氣速率常數(%·h?1)。

累積產氣量(m L) = 培養管產氣量?空白管產氣量。

1.4.2 消化能、干物質消失率、中性洗滌纖維消失率及pH 的測定

消化能(DE)可由產氣量與常規營養指標估算得出[19]：DE = 0.138 4 × GP + 0.142% × CP + 0.111% ×EE + 2.86；式中：GP 為產氣總量，CP 為培養底物的粗蛋白含量，EE 為培養底物的粗脂肪含量。將發酵底物于65 ℃烘箱中烘6 h，烘3 次至恒重根據如下公式計算干物質消失率(IVDMD)、中性洗滌纖維消失率(IVNDFD)。

IVDMD = [(底物重量?殘留底物重量)/底物重量] × 100%；

IVNDFD = [(底物NDF 含量?殘留底物NDF 含量)/底物NDF 含量] × 100%。

通過臺式酸度計(HANNA HI221 型)測定發酵液pH。

1.4.3 氨態氮(NH3-N)濃度和微生物蛋白(MCP)測定

通過比色法[20]利用紫外可見分光光度計(波長625 nm)測定吸光值，通過標準曲線得出發酵液的氨態氮濃度。微生物蛋白的測定依據Wang 等[21]差速離心法，對菌體蛋白進行分離，將分離出的菌體蛋白轉移至消化管中，用考馬斯亮藍法進行測定。

1.4.4 揮發性脂肪酸濃度、甲烷(CH4)的測定

參考文獻[22-23]，揮發性脂肪酸(VFA) 采用氣相色譜儀(日本島津GC–2014)進行測定，氣相色譜條件為，載氣：N2(40 m L·m in?1)，分流比40 ? 1，進樣量1 μL，進樣孔溫度：250 ℃，輔助箱溫度：250 ℃，氣化室溫度：250 ℃，FID 檢測器溫度：250 ℃，色譜柱型號：AT-FFAP 毛細管填充柱(30.0 m × 0.32 μm)。恒流模式，流量2.1 m L·m in?1，平均線速度38 cm ·s?1，柱壓11.3 psi (0.1 Mpa)，柱溫箱程序升溫范圍：90～150 ℃。CH4采用氣象色譜儀(日本島津GC–2014)進行測定，氣相色譜條件為，載氣：N2(40 m L·m in?1)，進樣量100 μL，進樣口溫度：60 ℃，柱溫50 ℃，TCD檢測器溫度：100 ℃，熱絲溫度：150 ℃。甲烷計算公式為：甲烷產量(m L) = 總產氣量 × 甲烷所占百分比。

1.4.5 組合效應指數的計算

單項組合效應值( SFAEI)、綜合組合效應指數(MFAEI)參照王旭[10]所使用的方法計算，即SFAEI =[組合后某參數實測值 ? (組分一實測值 × 其所占比例 + 組分二實測值 × 其所占比例)]/(組分一實測值 ×其所占比例 + 組分二實測值 × 其所占比例)；MFAEI =∑S FAEI。

1.5 數據處理與分析

試驗數據經Excel 2016 進行整理后，通過SPSS 20.0 軟件的單因素ANOVA 程序分析。以P ＜ 0.05為差異顯著判斷標準，以0.05 ≤ P ＜ 0.10 為有變化趨勢判斷標準。差異顯著時，采用Duncan 氏SSR法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 各時間段不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合在對累積產氣量和產氣參數的影響

各GI 組合GP 隨著培養時間延長而增長(表3)，在3～48 h，GI 為6.21 組合的累積產氣量顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；各時間點的累積產氣量隨著GI減小呈現出先升高后降低的趨勢，各組合潛在產氣量和產氣速率常數均差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 3 不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合對累積產氣量的影響Table 3 Effects of different GI of wheat straw–alfalfa hay proportions on gas production

2.2 各時間段不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對干物質消失率、中性洗滌纖維消失率、氨態氮、微生物蛋白的影響

發酵3 h 時，GI 為6.21 組合與GI 為7.03 和5.38的組合之間IVDMD 差異不顯著(P ＞ 0.05) (表4)，但顯著高于4.55、3.72 組合(P ＜ 0.05)；發酵48 h 時，GI 為6.21 的組合與GI 為7.03 組合的IVDMD 差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著高于GI 為5.38、4.55、3.72的組合(P ＜ 0.05)；發酵6～48 h 的IVDMD 隨著GI減小呈現降低趨勢，且在GI 為6.21 時達到最大值。

表 4 不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對IVDMD、IVNDFD、NH3-N 和MCP 的影響Table 4 Effects of different GI of wheat straw–alfalfa hay proportions on IVDMD、IVNDFD、NH3-N, and MCP and pH

發酵3、12、48 h 時，GI 為7.03 組合的IVNDFD與GI 為6.21 組合的差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；發酵6 h 時，GI 為7.03 組合的IVNDFD 顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；3～12 h 的IVNDF 隨著GI 減小呈現降低趨勢，48 h 的IVNDF隨著GI 減小呈現出先升高后降低趨勢。

發酵3、6、48 h 時，GI 為6.21 組合的NH3-N 濃度與GI 為7.03、5.38 組合之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但GI 為7.03、6.21、5.38 組合顯著高于GI 為4.55、3.72的組合(P ＜ 0.05)；發酵12～24 h 時，GI 為6.21 組合的NH3-N 濃度與GI 為7.03 組合之間差異不顯著，但顯著高于其他GI 的組合(P ＜ 0.05)；各時間段的NH3-N 濃度整體隨著GI 減小呈現先增加后降低趨勢。

發酵3～24 h 時，各組合的MCP 差異不顯著(P ＞0.05)，發酵48 h 時，GI 為6.21 的組合與GI 為7.03、5.38 的組合MCP 差異不顯著(P ＞ 0.05)，但GI 為6.21 的組合MCP 顯著高于GI 為4.55 和3.72 的組合(P ＜ 0.05)；且MCP 隨著GI 減小呈現出先小幅度增加再減小的趨勢。

發酵12～24 h 時，GI 為6.21 組合的pH 與GI為7.03 組合間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著低于其他組合(P ＜ 0.05)，發酵48 h 時，GI 為6.21 組合的pH 與GI 為7.03 和5.38 的組合間差異不顯著(P ＞0.05)，但顯著低于其他GI 的組合(P ＜ 0.05)。

2.3 各時間段不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合在對發酵液VFAs 的影響

發酵3 h 時，GI 為6.21 的組合乙酸濃度顯著高于其他組合(P ＜ 0.05) (表5)；發酵48 h 時，GI 為7.03、6.21、5.38 組合的乙酸濃度差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著高于GI 為4.55 和3.72 的組合(P ＜ 0.05)。發酵48 h 的乙酸濃度隨著GI 減小呈現出先增加后降低的趨勢。

表 5 不同苜蓿干草–小麥秸稈組合對乙酸、丙酸和總揮發性脂肪酸的影響Table 5 Effects of different combinations of alfalfa hay–wheat straw on acetic acid, propionic acid, and total volatile fatty acids

發酵3 h 時，GI 為6.21 的組合丙酸濃度顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；發酵6～12 h 時，各組合的丙酸濃度差異不顯著(P ＞ 0.05)；發酵24 h 時，GI 為6.21 的組合與GI 為5.38 組合的丙酸濃度差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著高于GI 為7.03、4.55、3.72 的組合(P ＜ 0.05)；發酵48 h 時，GI 為7.03 和6.21 組合的丙酸濃度差異不顯著(P ＞ 0.05)，但GI 為6.21 的組合顯著高于GI 為5.38、4.55、3.72 的組合(P ＞ 0.05)；發酵24 和48 h 時，丙酸隨著GI 減小呈現出先增加后降低趨勢。

發酵3 h 時，GI 為6.21 組合的總揮發性脂肪酸濃度顯著高于GI 為7.03、5.38、4.55、3.72 的(P ＜ 0.01)；發酵48 h 時，GI 為6.21 組合的總揮發性脂肪酸濃度與7.03 組合差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著高于5.38、4.55、3.72 的組合(P ＜ 0.05)；發酵3 和48 h 時，TVFA 隨著GI 減小呈現出先升高后降低趨勢。

2.4 各時間段不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合在對甲烷和消化能的影響

發酵3～24 h 時，GI 為6.21 組合的CH4含量顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；各時間段的CH4含量隨著GI 減小呈現出先升高后降低趨勢，發酵48 h 時各組合無顯著差異(P ＞ 0.05)。發酵3～48 h 時，GI為6.21 的組合DE 顯著高于其他組合(P ＜ 0.05)；各時間段的DE 隨著GI 減小呈現出先升高后降低趨勢 (表6)。

2.5 不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對綜合組合效應值的影響

GI 為7.03、6.21、5.38 的組合在各時間段均產生了正組合效應，GI 為4.55 和3.72 的組合在48 h 產生了正組合效應，但在3～24 h 產生了組合的負效應。各時間段GI 為6.21 組合的MFAEI 均高于其他GI 組合 (表7)。

3 討論

3.1 不同GI 的苜蓿干草–小麥秸稈組合對累積產氣量和干物質降解率的影響

底物發酵程度可通過產氣量體現，也可呈現出了瘤胃微生物活躍程度和日糧的可消化性[24-26]。本研究中各組合GP 隨培養時間增加而增加，產氣速率常數無差異，說明體外發酵處于正常狀態，且GP 與IVDMD、IVNDFD 兩指標均呈正相關關系。本研究中，各時間點的累積產氣量隨著GI 減小呈現先升高后降低的趨勢，發酵3 h 的 IVDMD 以及發酵3、6、12 h 的IVNDFD 均隨著GI 減小呈現下降趨勢，說明高蛋白質的苜蓿干草可顯著改善小麥秸稈的發酵能力，促進纖維物質的消化，但在各時間段GI 為7.03 組合的IVDMD、IVNDFD 與GI 為6.21 的組合基本上差異不顯著，說明苜蓿干草雖能提高小麥秸稈的消化率但也有限度。Silva 等[27]試驗結果表明，在只提供秸稈類粗飼料時，會限制微生物的增殖，當提供易消化的纖維飼料時，纖維分解菌首先會附著于優質的粗飼料中進行分解和增殖，同時也提高了秸稈類飼料的利用率，與本研究結果一致。

表 7 不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對綜合組合效應值的影響Table 7 Effects of different GI of alfalfa hay–wheat straw proportions on multip le factors associative effects index

3.2 不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對牦牛瘤胃體外發酵參數的影響

pH 高低是牦牛瘤胃發酵功能、內環境穩態、有機酸生成以及微生物活性的最直接表現[28]。研究顯示, 反芻動物瘤胃液pH 正常變動范圍為6.0～7.5[29-30]。本研究各GI 組合的pH 為6.80～7.32，均在正常范圍內。本研究中，NH3-N 濃度隨著GI 的減小，呈現先升高后降低的趨勢，其原因是由于苜蓿干草與小麥秸稈中的蛋白質含量差距較大，前者為后者的3.48 倍左右，彌補了蛋白質不足的缺陷，為瘤胃微生物提供了較充足的氮源；而后隨著GI 的減小逐漸下降，原因可能是該組合皆為粗飼料組合，其中為瘤胃微生物提供能量的可發酵碳水化合物含量較低，導致NH3-N 逐漸下降，這與楊麗[31]報道的隨著營養水平的降低，發酵效果降低的結果基本一致。

MCP 可為反芻動物瘤胃氮主要的來源，且NH3-N濃度又是影響MCP 合成的重要因素[18]；若NH3-N濃度過高會浪費營養源，過低會降低瘤胃微生物活性[32-33]。相關研究指出[34-36]， NH3-N 濃度為0.35～29 mg·dL?1就可為微生物提供充足氮源合成MCP，2～5 mg·dL?1就可滿足細菌對纖維降解的需求。本研究中各GI 指數組合的NH3-N 濃度均大于或等于10.87 mg·dL?1，足以滿足瘤胃微生物生長的需要。因此，粗飼料纖維的有效降解是合成MCP 的主要限制因素，GI 為6.21 的組合NH3-N 濃度、MCP 濃度均最高，原因可能是GI 為6.21 的組合提供了合適的碳、氮等營養素，使各元素含量達到相對平衡，給予了瘤胃微生物合適的生長環境。

3.3 不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合對能量的影響

VFA 主要通過底物中碳水化合物的發酵而來，而各GI 組合所含有的碳水化合物的相對比例不同，影響了瘤胃發酵內環境，進而影響瘤胃內揮發性脂肪酸的產生量。在本研究中，粗飼料在瘤胃內發酵產生乙酸比例可以達到總揮發性脂肪酸的59%～63%，而丙酸比例只有19%～22%，且各GI 組合的乙酸產量均高于丙酸產量，這與Petersen 的研究結果[36]較為一致。分析原因為本研究各組合皆為粗飼料組合，均含有大量的纖維素，在發酵過程中纖維素產生的乙酸比例要高。

當苜蓿干草–小麥秸稈組合GI 為6.21 時乙酸、丙酸、總揮發性脂肪酸濃度最高，意味著這一組合中可消化的碳水化合物含量較高。乙酸有利于提高動物的體脂率，丙酸有利于葡萄糖的轉化和儲存[37-38]，并且丙酸含量對反芻動物的采食量具有一定的影響，因此，對于反芻動物而言，可以通過提高瘤胃發酵過程中丙酸的比例來提高飼料的轉化效率。本研究通過改變苜蓿干草–小麥秸稈組合的GI 值提高了丙酸生成量，進而提高人工瘤胃對飼料的降解率，這一結果與孟梅娟等[39]得出隨著小麥秸稈比例降低，乙酸、丙酸和總揮發性脂肪酸均降低的結果基本一致。

本研究中GI 為6.21 時粗飼料組合的甲烷產量最高，馮仰廉[30]指出，瘤胃可發酵中性洗滌纖維對甲烷影響很大，而本研究中各組合 IVNDFD 與甲烷產量趨勢較為一致。這也充分可以說明各GI 組合中性洗滌纖維含量對產甲烷菌的生長繁殖有一定影響。因此，GI 為6.21 組合的甲烷產量最高的原因可能是這一組合為瘤胃微生物提供了較為合適的生長環境，其中的纖維在瘤胃內降解率提高，導致甲烷產量增多，這一結果與王增林等[40]、鄭文思等[41]的隨著飼糧NDF 的提高，飼糧體外發酵的甲烷相對產量有所上升研究結果相似。

消化能是日糧消化后真正被機體利用吸收的能量，可以真實地衡量反芻動物對飼料的利用情況，以消化能為基礎配制反芻動物飼料配方更能提高飼料的利用效率[42]。發酵48 h 后DE 隨著GI 的降低呈現先增大后減小的趨勢，分析原因為隨著GI變化，各組合為瘤胃微生物提供的營養及環境發生變化，導致消化能隨之改變。

3.4 不同GI 苜蓿干草–小麥秸稈組合對MFAEI的影響

王旭[10]以分級指數 GI 和MFAEI 為依據，組合配比不同種類飼草，最大程度地發揮粗飼料間的正組合效應，提高動物的生產性能，從而降低精料的使用量、節約了飼養成本。因此，本研究也采用了MFAEI 評價各GI 組合的組合效應。隨著時間的延長各GI 組合的組合效應值逐漸增大；且MFAEI 隨著GI 減小呈現先升高后降低的趨勢，說明適宜的苜蓿干草與小麥秸稈的比例可以提高組合效應值。分析原因可能是不同GI 小麥秸稈–苜蓿干草組合，其營養組成不一致，進而使微生物存在的發酵環境發生改變，提高了微生物對飼料的利用率，該結果也與張吉鹍[43]得出混合日糧粗飼料 GI 較高時不用增加精料即可獲得良好的效益這一結果相近。

4 結論

根據各項瘤胃發酵指標以及組合效應綜合得出，GI 為6.21 的處理苜蓿干草–小麥秸稈組合體外發酵效果優于其他GI 組合。因此，當苜蓿干草–小麥秸稈組合的GI 為6.21 時，其更能優化瘤胃發酵環境，增加飼料的利用率。