飼料添加黃金蟲蟲粉對小鼠腸道炎癥相關細胞因子表達的影響

金鑫鑫，鞏宇紅，袁渤雨，劉明明，吳文湘，陳 純，蘇銘信，王 瑋,*

(1.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春130062;2.仲愷農業工程學院 動物科學學院 健康養殖創新研究院，廣東 廣州 510225)

“黃金蟲”蠅蛆是一種繁殖量很大的經濟昆蟲，是家蠅的幼蟲，可以作為畜牧生產中的蛋白原料添加劑。蠅蛆中含有的抗菌肽屬于陽離子堿性多肽，具有熱穩定性和廣譜抗菌性[1]?？咕木哂忻庖哒{節作用，能促進免疫細胞增殖、激活特異性免疫應答反應、消除炎癥、增強宿主抵抗力和調節免疫因子活性等[2]?？咕倪€能有效抵抗外來病原微生物的侵害[3]。

黃金蟲干蟲蛋白質含量50%以上，此外，還含有磷、鉀、鐵、鈉、鋁等常量元素和多種微量元素，以及動物生長所必需的18種氨基酸[4]。甲殼素是黃金蟲體內寶貴的天然生物資源,主要分布于外表皮,黃金蟲中的甲殼素含量高于蝦蟹殼，具有提高免疫力、抗菌抗感染、抗病毒的作用[5]。黃金蟲干粉中含有脂溶性和水溶性維生素，水溶性微生素中B族的含量非常豐富，尤其是維生素B2和維生素B12[6]。黃金蟲體內含殼聚糖，可增強小鼠的細胞免疫、體液免疫、單核巨噬細胞功能和NK細胞活性，對動物機體具有多種免疫調節作用[7]。

小鼠腸道防御素包括Cryptdin-1、Cryptdin-5等，它能殺死入侵機體的病原體，也能調節機體的免疫功能[8]。當小鼠腸道受到病原菌侵害時，炎性細胞因子的表達量會明顯變化[9]。本試驗以小鼠為模式動物，通過日糧添加不同比例的黃金蟲蟲粉，觀察不同添加比例的黃金蟲蟲粉對小鼠腸道不同部位炎癥相關細胞因子及鼠源抗菌肽表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料黃金蟲干粉由廣東金農良品有限公司提供，用粉碎機粉碎后，以5%，10%，20%的比例添加到鼠糧干粉中，混勻后制作成鼠糧。

1.2 實驗小鼠及分組選用體質量為(43±2) g的6～8周健康雄性昆明種小鼠28只，隨機分為4組：對照組、5%黃金蟲添加組、10%黃金蟲添加組和20%黃金蟲添加組。對照組小鼠添加正常鼠糧，試驗組分別添加含5%，10%，20%黃金蟲蟲粉的鼠糧，正常飲水，飼喂2周。

1.3 小鼠腹瀉模型誘導從-80℃冰箱取出鼠傷寒沙門菌(菌株編號：SL1344)菌株融化復蘇后，接種到BHI液體培養基，37℃恒溫搖床上過夜培養，收集細菌，調節濃度到 1×108CFU/mL。給小鼠灌胃0.05 mL/g的沙門菌菌液建立腹瀉模型，連續3 d，誘導產生腹瀉模型，記錄腹瀉及死亡情況。

1.4 組織RNA的提取從-80℃冰箱中取出50 mg 樣品，放入液氮中，然后再在5 mL離心管中加入適量的液氮，多次用玻璃棒研磨至粉末狀。加入1 mL TRIzol，于室溫放置10 min，使其充分裂解，并將液體轉移至1.5 mL離心管中。按照200 μL 氯仿/mL TRIzol，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min，于4℃ 12 000 r/min離心10 min。取出，室溫放置約2 min，等出現白色沉淀后，吸取上清水相，移入另一個離心管中，注意不能吸入脂肪層，按500 μL異丙醇/mL TRIzol，加入500 μL異丙醇，蓋蓋，上下顛倒10次，-20℃過夜。第2天取出融化后4℃ 12 000 r/min離心10 min,棄去上清液，此時管底的沉淀即為RNA。加入75%乙醇1 mL，然后平拿離心管，慢慢轉幾圈，將乙醇吸出。再加入75%乙醇 1 mL，轉幾圈后再將乙醇移除。RNA先是白色，然后慢慢變成透明狀態。等沉淀幾乎透明后，加入20 μL的DEPC水，振蕩至沉淀溶解后測定RNA濃度。

1.5 熒光定量PCR檢測炎性因子取小鼠空腸、回腸和結腸，提取RNA，并反轉錄為cDNA，然后做相對熒光定量PCR，檢測小鼠體內空腸、回腸和結腸中的抗炎因子、促炎因子和抗菌肽的相對表達量。

促炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6；抗炎因子：IL-4、IL-10、IL-13；抗菌肽：Ang-4、Cryptdin-1、Cryptdin-5、Lyz2、Crs1c、Reg3r。

采用實時熒光定量PCR法檢測小鼠灌菌前后腸道炎性因子的表達水平變化。將得到的RNA 反轉錄成cDNA后，按熒光染料10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 8 μL，總體系20 μL加樣，每組3個重復，混勻后離心，進行熒光定量檢測。引物序列如表1。

2 結果

2.1 腹瀉模型的建立結果顯示，對照組7只小鼠，6只出現腹瀉現象，死亡1只；5%黃金蟲添加組7只小鼠，2只出現腹瀉，未死亡；10%黃金蟲添加組7只小鼠、20%黃金蟲添加組7只小鼠，均未出現腹瀉或死亡現象。

2.2 黃金蟲飼喂對小鼠空腸炎性因子相對表達量的影響結果表明，日糧中添加黃金蟲蟲粉，小鼠灌胃沙門菌后，空腸中促炎細胞因子表達量降低，抗炎細胞因子表達量升高，抗菌肽表達量也升高，這有利于小鼠的生長發育，提高小鼠抵御炎癥反應的能力。空腸為小腸，主要起消化吸收作用，促炎因子、抗炎因子和鼠源抗菌肽的表達量會影響小鼠的生長發育及抗病能力。

表1 引物序列及擴增產物長度

2.2.1腫瘤壞死因子(TNF-α) 見圖1。結果顯示，黃金蟲蟲粉添加組TNF-α表達量均降低，其中20%組最為顯著。

2.2.2抗炎因子 見圖2。結果顯示，與對照組相比，黃金蟲蟲粉添加組空腸中抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達量均升高，其中20%添加組差異顯著或極顯著。

注：*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.2.3鼠源抗菌肽 見圖3。結果顯示，空腸中抗菌肽Ang4、Cryptdin-1、Cryptdin-5、Lyz2、Reg3r和Crs1c的表達量較對照組都有明顯上升。Ang4、 Cryptdin-1、Cryptdin-5和Crs1c的表達量隨著黃金蟲添加比例的增加而上升，20%添加組最為顯著。Lyz2、Reg3c的表達量5%添加組最高，與對照組有顯著性差異，10%添加組和20%添加組比5%添加組低，但均高于對照組。

2.3 回腸炎性因子相對表達量

2.3.1促炎因子 見圖4。結果顯示，黃金蟲蟲粉添加組回腸中的促炎因子IL-6表達量較對照組明顯降低。

圖2 空腸抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達量

2.3.2抗炎因子 見圖5。結果顯示，黃金蟲蟲粉添加組回腸中的抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達量較對對照組均有所上升。

2.3.3鼠源抗菌肽 見圖6。結果顯示，試驗組回腸中抗菌肽Ang4和Crs1c的表達量較對照組明顯上升，其中Cryptdin-1、Cryptdin-5和Reg3r的表達量10%添加組最高，其他組表達量均低于對照組。

2.4 結腸炎性因子相對表達量見表7～9。結果

圖3 空腸抗菌肽Ang4、Crs1c、Cryptdin-1、ryptdin-5、Reg3r和Lyz2的表達量

圖4 回腸促炎因子IL-6的表達量

顯示，黃金蟲蟲粉添加組中結腸的促炎因子TNF-α和IL-6的表達量較對照組均降低，而抗炎因子IL-13表達量試驗組較對照組增高,IL-4的表達量略微降低，IL-10變化不明顯。試驗組結腸的抗菌肽Ang4、Cryptdin-1、Reg3r和Crs1c的表達量較對照組都有明顯上升。其中，Ang4的表達量隨著黃金蟲添加比例的增加而上升，且20%添加組中最為顯著，而Cryptdin-1的表達量在5%添加組中最高、Reg3r的表達量在10%添加組中最高。

2.4.1促炎因子 見圖7。結果顯示，黃金蟲蟲粉添加組中促炎因子TNF-α和IL-6的表達量與對照組相比，均呈降低趨勢。

2.4.2抗炎因子 見圖8。結果顯示，黃金蟲蟲粉添加組中抗炎因子與對照組相比，IL-4表達量下降，IL-10變化不明顯，IL-13升高。

2.4.3鼠源抗菌肽 見圖9。結果顯示，與對照組相比，黃金蟲蟲粉添加組抗菌肽表達量均增加。

圖5 回腸抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達量

圖6 回腸抗菌肽Cryptdin-1、Cryptdin-5、Reg3r、Ang4和Crs1c的表達量

圖7 結腸促炎因子TNF-α和IL-6的表達量

圖8 結腸抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達量

3 討論

黃金蟲粉末中富含甲殼素和殼聚糖，對動物生長發育有促進作用。楊冬之等[10]研究證明殼聚糖分子吸附到細菌細胞壁上，使細胞壁和細胞膜上負電荷分布不均，干擾細胞壁合成，導致細菌裂解而死亡。

當沙門菌感染小鼠時，動物腸道菌群失調，腸道免疫屏障被破壞，會導致腸道炎癥的發生，出現腹瀉癥狀或死亡[11-12]。日糧中添加適當比例黃金蟲蟲粉，能提高小鼠的機體免疫力，在沙門菌侵害腸道時，能增加腸道對病原菌的抵抗力以及提高機體抵御炎癥反應的能力，維持腸道菌群的平衡，對沙門菌破壞腸道有一定抵抗作用[13]。本試驗結果顯示，對照組6只小鼠出現腹瀉癥狀，1只死亡；試驗組5%黃金蟲添加組中2只小鼠出現腹瀉癥狀，而10%黃金蟲添加組、20%黃金蟲添加組小鼠沒有出現腹瀉及死亡的情況，這驗證了黃金蟲蟲粉的添加能保護小鼠腸道對抗沙門菌的侵害。

圖9 結腸抗菌肽Ang4、Crs1c、Cryptdin-1和Reg3r的表達量

雖然各組在不同腸道中每種因子的表達量不同，總體上看，按20%黃金蟲比例添加的試驗組，各種因子趨勢最明顯，但有個別抗菌肽因子如Cryptdin-1、Cryptdin-5和Reg3r雖有降低，但均高于對照組。而添加10%比例黃金蟲的試驗組，雖個別細胞因子漲幅沒有20%組明顯，但對于細胞因子和鼠源抗菌肽的產生都具有積極的調控作用；因此，10%添加量對動物的生長及免疫力具有較好的促進作用。

有研究證明，蠅蛆粉可以提高水產動物的抗病能力、成活率和增重率。黃國慶等[14]研究證明蠅蛆代替人工飼料喂養羅非魚能增強魚體的免疫力，提高成活率，試驗組的日平均增重率顯著高于對照組。李廣宏等[15]研究表明，蠅蛆蛋白飼喂的麻雞其蛋白質含量明顯高于普通日糧對照組。王穎娟等[16]觀察日糧中添加不同比例鮮蠅蛆對興義矮腳雞生長速度、產肉性能及肉品質的影響，發現鮮蠅蛆飼喂興義矮腳雞可以加快生長速度，降低雞肉中的水分含量，提高肌肉的營養價值。LI等[17]研究豬飼料中添加8%蠅蛆粉對寧鄉豬生長性能和腸道微生物平衡的影響，結果發現飼料中添加8%蠅蛆粉可以顯著增加育肥豬的平均日增重，抑制腸道有害菌的生長，促進益生菌的增殖，并且有效提高對營養物質的消化吸收能力。

總之，黃金蟲作為飼料添加劑應用于畜禽養殖，是無抗養殖的一種新的嘗試，可以作為蛋白質飼料的有益補充，同時可以提高機體的免疫機能對抗腸道局部炎癥，還能避免細菌耐藥性的出現。黃金蟲蟲粉能作為營養物質，調節腸道炎性因子的表達，有望作為蛋白替代物應用到飼料添加劑中。因此，本研究為開發新型飼料或飼料添加劑提供一定的試驗依據。