瘤胃微生物在奶牛乳脂肪合成中的調節作用研究進展

吳建民，王建發，武 瑞

(黑龍江八一農墾大學 動物科技學院 黑龍江省牛病防治重點實驗室，黑龍江 大慶 163319)

乳脂肪作為牛乳的重要營養物質及關鍵評價指標備受廣大研究者關注。乳脂肪含有人體必需的礦物質以及脂溶性維生素。有研究證明，乳脂肪中豐富的共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)對于下調人體膽固醇[1]與低密度脂蛋白含量[2]、抵抗動脈粥樣硬化[3]等具有重要功效。奶酪作為牛乳進一步加工的產品在國際乳制品高端市場占有重要地位，而乳脂肪對于奶酪的風味具有重要影響，不僅因為合成乳脂肪的脂肪酸(fatty acid,FA)本身是風味物質，同時也是奶酪中甲基酮、仲醇、內酯、酯等風味物質的前體物[4]。因此，安全有效地提高牛乳中乳脂肪含量是加強我國乳業在國際市場上核心競爭力的必要手段之一。

消化道微生物與機體的生理代謝、免疫防御[5]、消化吸收[6]和行為方式等聯系密切。在奶牛體內，瘤胃微生物參與眾多生理作用，是保證其消化及能量循環有序進行的必要基礎[7]。日糧中的營養物質首先通過瘤胃微生物的降解作用轉化為可供奶牛機體利用的小分子物質，再進入各個系統發揮功能，對奶牛的生產性能具有顯著影響[8]，其正常的生理狀態更是保證奶牛機體穩態的重要前提[9]。近年來的研究熱點主要集中在微生物影響宿主健康、調節宿主生理機能[10]等方面的潛在作用，而乳脂肪合成前體物的生成均受到瘤胃微生物的調節作用，其合成情況決定最終乳中脂肪含量的高低。因此，了解瘤胃微生物對乳脂肪合成前體物的生理功能、作用方式及影響因素，對提高牛乳中脂肪含量具有重要意義。

1 乳脂肪合成過程及影響因素

1.1 乳脂肪成分及乳脂肪酸合成途徑乳脂肪在牛乳中含量為3%～5%，主要成分為甘油三酯(triglyceride,TG)，約占全部乳脂肪的98%，其余物質為二酰甘油(diacylglycero,DAG)、單酰甘油(monoacylglycerol,MAG)、磷脂(phospholipid,PL)、糖脂、膽固醇(cholesterol,CHO)、游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)以及脂溶性維生素等。

乳脂肪由奶牛乳腺上皮細胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)對脂肪酸加工而成。其合成所用的脂肪酸通常認為有兩種來源：一種以瘤胃內微生物酵解日糧中碳水化合物而產生的揮發性脂肪酸為主要前體物質，再由DCMECs從頭合成，包括中短鏈脂肪酸(C4～C14)和50%的C16脂肪酸，占牛乳中總脂肪酸的40%～45%。另一種以瘤胃內微生物分解日糧中脂肪而產生的脂肪酸為主要前體物質，進入血液循環流經乳腺組織時由DCMECs直接攝取利用，包括全部長鏈脂肪酸(C16以上)和余下50%的C16脂肪酸，占牛乳中總脂肪酸的55%～60%[11]；此外，奶牛體脂動員時血漿內與白蛋白結合的游離脂肪酸也可以經脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)水解后被DCMECs利用合成乳脂肪[12]，尤其當奶牛機體處于能量負平衡狀態時，DCMECs主要利用經體脂動員而獲得的長鏈脂肪酸合成乳脂肪。

1.2 影響乳脂肪合成的非自身代謝性因素乳脂肪含量是牛乳中最易產生浮動的指標之一，不同的飼養環境、管理方式、日糧結構，奶牛自身的健康狀況，不同品種、胎次、泌乳時期、年齡等多種因素都可對最終牛乳中乳脂肪含量產生不同程度的影響。研究表明，在日糧中添加飽和脂肪酸對乳脂肪合成具有促進的作用；添加脂肪或油脂可以影響乳脂肪中脂肪酸的組成；在奶牛日糧中添加植物油，可以提高乳脂肪中反式脂肪酸的比例。另有研究發現，在高比例粗飼料的日糧中添加葵花子油時，乳中C18:0和C18:19顯著提高[13]；當日糧中精粗比達到3∶2時，會引起乳脂肪合成下降[14]。當奶牛發生亞急性瘤胃酸中毒時，乳脂肪率一般下降到0.8%～1.0%；當環境溫度超過30℃時，奶牛遭受熱應激可引發乳脂肪合成下降。中國荷斯坦奶牛的正常乳脂肪含量為3.5%～3.7%，而牦牛的乳脂肪含量可達到7.5%以上。通常情況下隨著奶牛生產胎次的增加，脂肪酸含量會逐漸降低[15]。

1.3 影響乳脂肪合成的自身代謝性因素奶牛日糧中碳水化合物經過瘤胃微生物作用轉變為丙酮酸[16]，在瘤胃內進入不同的代謝途徑轉變為揮發性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)，約有80%的VFA被瘤胃壁和網胃壁吸收，剩余的VFA經消化道其他組織吸收后利用；日糧中脂類物質經過瘤胃微生物作用轉變為非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)和VFA。

瘤胃微生物對日糧營養元素的酵解作用是乳脂肪合成的始動因素。進入血液循環后經由門靜脈的VFA有60%～84%被肝臟吸收[17]，約有80%的丙酸用于糖異生，是奶牛合成葡萄糖的主要來源[18]，但進入肝臟的NEFA主要來源于體脂動員，這些NEFA可以經過β-氧化途徑生成Acetyl-CoA，其中一部分進入檸檬酸循環氧化代謝，另一部分被氧化生成β-羥丁酸等酮體物質；或者被酯化生成TG后與載脂蛋白結合以極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)形式[19]從肝臟轉運入血。乳腺組織是前體物最終合成乳脂肪的場所，DCMECs將從頭合成而來的脂肪酸或從血液中攝取的NEFA進一步去飽和化后，再將其合成TG。合成TG的過程在DCMECs的內質網上進行，脂肪酸以脂酰輔酶A的形式酯化在α-磷酸甘油上[20]。

2 瘤胃微生物的代謝調控作用

2.1 瘤胃微生物的種類瘤胃微生物被喻為奶牛自身的“隱形器官”，通常包括細菌(1010～1011cells/mL)、真菌(103～106cells/mL)和原蟲(104～106cells/mL)[21]等。專性厭氧菌為瘤胃微生物主要成分，優勢門水平細菌分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，共有超過7 400個種水平細菌[22]。不同年齡奶牛瘤胃內優勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[23]。HENDERSON等[7]應用高通量測序技術對來自于世界各地的742頭反芻動物瘤胃內容物進行檢測發現，奶牛品種、地理分布和日糧結構等因素均對瘤胃微生物產生了一定的影響，但優勢菌群大體相同；普雷沃菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)為屬水平優勢菌。

2.2 瘤胃微生物的代謝調控作用大多數瘤胃微生物編碼碳水化合物降解酶或與碳水化合物降解相關的結合蛋白。依照作用底物不同，可以將瘤胃微生物分為纖維素降解類、淀粉降解類等。產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、溶纖維真桿菌(Eubacteriumcellulosolvens)、棲瘤胃普雷沃菌(Prevotellaruminicola)、反芻動物真桿菌(Eubacteriumruminantium)等為瘤胃微生物中主要的纖維素降解菌。其中革蘭陰性菌的F.succinogenes與革蘭陽性菌的R.albus和R.flavefaciens為瘤胃內相對豐度最高且纖維素降解能力最強的3個菌種。瘤胃中的真菌、原蟲等也可以降解纖維素[24]。這些微生物將日糧中纖維素類物質逐步降解為單糖供機體利用。

嗜淀粉瘤胃桿菌屬、棲瘤胃普雷沃菌屬、牛鏈球菌屬、溶淀粉琥珀酸單胞菌屬、反芻獸新月形單胞菌屬、溶纖維丁酸弧菌屬、雙歧桿菌屬和梭菌屬等細菌，內毛蟲屬和雙毛蟲屬等原蟲，以及瘤胃內部分厭氧真菌幾乎全部可以產生α-淀粉酶，將淀粉水解為麥芽糖[25]后再進一步降解為單糖供機體利用。

瘤胃內微生物的組成結構亦會受到日糧中各營養物質比例的影響。奶牛日糧為高脂肪低纖維結構時，原蟲和真菌的數量會出現降低的趨勢，同時普雷沃菌屬、琥珀酸絲狀桿菌屬的相對豐度會下調，而牛鏈球菌屬會出現顯著升高[26]。當奶牛日糧結構為高粗料日糧時，纖維桿菌門相對豐度會顯著升高[27]。

3 瘤胃微生物對乳脂肪合成的影響

3.1 瘤胃微生物調節揮發性脂肪酸生成的機制瘤胃微生物通過自身合成的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)以及碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding modules,CBMs)等酶類將日糧中碳水化合物酵解為二糖或單糖形式，經過瘤胃內進一步代謝后以Acetyl-CoA為底物形式合成VFA(主要為乙酸和丁酸)，其中合成乙酸的途徑主要有4種：乙酸磷酸轉移酶-抑酸激酶(PTA-ACK)途徑，Acetyl-CoA的硫酯鍵被磷酸乙酰轉移酶(phosphotransacetylase,PTA,EC：2.3.1.8)磷酸化降解，生成乙酰磷酸，再被乙酸激酶(acetate kinase,ACK,EC：2.7.2.1)催化[28]，產生乙酸與ATP；乙酰輔酶A生成酶(ACS(ADP))途徑，Acetyl-CoA經乙酰輔酶A生成酶[acetyl-CoA synthetase(ADP-forming),ACS(ADP),EC：6.2.1.13]作用后產生乙酸[28]；乙酸-琥珀酸輔酶A轉移酶(ASCT)途徑，Acetyl-CoA的輔酶A基團經乙酸-琥珀酸輔酶A轉移酶(acetate-succinate CoA-transferase,ASCT,EC：2.8.3.18)作用轉移給琥珀酸[27]而產生乙酸與琥珀酸輔酶A；乙酰輔酶A水解酶(ACH)途徑，Acetyl-CoA的硫酯鍵被乙酰輔酶A水解酶/硫酯酶(acetyl-CoA hydrolase/thioesterases,ACH,EC：3.1.2.1)水解[28]，進而生成乙酸。此外，部分微生物還可以在瘤胃內厭氧條件下利用CO2為底物，通過Wood-Ljungdahl pathway途徑[29]產生乙酸。

以Acetyl-CoA為底物合成丁酸的途徑主要包括Acetyl-CoA向丁酰輔酶A(butyryl-CoA)轉變的中心途徑(central pathway)和butyryl-CoA向丁酸轉變兩個過程[30]，后者一般有3種途徑：通過磷酸丁酰轉移酶(phosphotransbutyrylase,PTB)和丁酸激酶(butyrate kinase,BK)產生丁酸，稱為PTB-BK途徑；在乙酸存在時通過輔酶A轉移酶(acetate CoA-transferase)產生丁酸，稱為BCACT途徑；在乙酰乙酸鹽存在時通過輔酶A轉移酶(butyryl-CoA-acetoacetate CoA-transferase)產生丁酸[31]，稱為BCAACT途徑。

3.2 瘤胃微生物調節中長鏈脂肪酸生成的機制瘤胃微生物利用自身合成的脂解酶[25]水解日糧中脂類物質產生甘油、半乳糖和不飽和的NEFA，在進一步的氫化作用下，不飽和的NEFA被飽和，半乳糖和甘油轉化為VFA，小部分NEFA和大部分VFA經瘤胃壁吸收入血。此外，一部分脂類以過瘤胃脂肪和菌體磷脂膜的形式到達十二指腸，經胰脂酶作用后轉變為NEFA，進而被空腸吸收，再轉化為低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，經過淋巴管運輸到達乳腺組織處。

不同種類的瘤胃微生物能夠作用于不同的底物，其中黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌分泌纖維素降解酶的能力較強；嗜淀粉瘤胃桿菌和牛鏈球菌對淀粉降解的能力較強[32]；脂解厭氧弧桿菌降解脂類物質的能力較強[33]。瘤胃內的厭氧真菌以及原蟲等微生物亦有不同程度的降解能力，但與瘤胃內脂類物質降解作用相關微生物的報道相對較少，有待研究人員的進一步闡明。

4 未來展望

綜上可見，在不同日糧結構下的瘤胃微生物具有不同的特點。高脂肪日糧時會增加與脂類降解相關的微生物同時降低與碳水化合物類降解相關的琥珀酸絲狀桿菌等微生物，而高纖維日糧時則會增加與碳水化合物類降解相關的微生物；而具備專一代謝功能的瘤胃微生物受到日糧結構的影響后其含量會發生變化，進而與之相關的代謝物產量會出現升高或降低，從而影響奶牛最終的生產性能指標。是否可以利用瘤胃微生物種間、群落間針對不同底物所表現出的優勢物種情況以及瘤胃內環境與微生物的互作機制，通過人為干預，改變瘤胃中與乳脂肪合成前體物相關的微生物及其所編碼的碳水化合物降解酶類和脂類物質降解酶類的含量與結構，進而提高最終牛乳中乳脂肪的含量，有待進一步的研究。明確這一問題對構建瘤胃微生物調節乳脂肪合成網絡具有重要意義。