黃芪多糖在LPS誘導的DF-1細胞炎癥反應中的抗炎作用及其調節機制

劉丹華，張瑞莉，田 旭，呂曉萍，高雪麗，鄭世民，劉超男

(東北農業大學 動物醫學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

炎癥是機體對各種生物、物理和化學刺激產生的病理反應[1]。當機體處于這種狀態時，會產生大量的炎癥因子如白細胞介素(interleukin ，IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等，對機體造成嚴重的炎癥損傷，從而給養殖業帶來巨大的經濟損失[2-3]。大量研究表明，IL-1β和TNF-α等炎性細胞因子的表達主要與NF-κBp65和p38MAPK信號通路的激活有關[4-5]。因而，抑制NF-κBp65和p38MAPK信號通路的活化成為抑制炎癥發生發展的重要方向。細胞因子信號轉導抑制因子(suppressers of cytokine signaling，SOCS)家族是一種負性調節蛋白，可能對NF-κBp65和p38MAPK的過度活化起到負反饋作用[6]。在炎癥進程中，SOCS1和SOCS3能通過抑制TLR/NF-κB信號通路的活化發揮抗炎作用[7-8]，但是SOCS3在禽類相關疾病炎癥進程中的抗炎作用及其機制仍不明確。

黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)是黃芪發揮藥效的主要生物活性物質，具有抑制炎癥、提高免疫、抑制腫瘤等多重生物學功能[9]。本研究旨在探索APS在LPS誘導的雞胚成纖維細胞系(chicken embryo fibroblasts，DF-1)炎癥反應中對促炎因子IL-1β和TNF-α表達的影響以及APS能否通過SOCS3對炎癥信號NF-κBp65和p38MAPK的活化起到調控作用，進而為闡明APS抑炎機制提供可靠的理論依據，為家禽免疫應激性疾病的防治提供臨床應用依據。

1 材料與方法

1.1 APS和DF-1細胞系APS由東北農業大學中獸醫教研室贈送，采取Sevag法進行制備，APS含量以葡萄糖(C6H12O6)計，經苯酚-硫酸法繪制糖含量標準曲線后測定APS相對含量為87.5%[10]。DF-1細胞系由東北農業大學病理生理教研室保存備用。

1.2 主要試劑及儀器兔抗NF-κBp65、P-NF-κBp65(Ser 536)、p38MAPK、P-p38MAPK(Thr180/Tyr182)和SOCS3抗體購自英國Abcam公司；鼠抗α-Tubulin和酶標二抗購自碧云天生物有限公司；LPS(大腸桿菌O55:B5)和CCK8試劑盒購自美國Sigma公司；DMEM培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司。

二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；Biometra TONE PCR儀(德國耶拿公司)；Light Cycler?480R(美國Roche公司)；Mini-PROTEAN Tetra System(美國BIO-RAD公司)；5430R低溫離心機(德國 Eppendorf 公司)。

1.3 LPS和APS應用質量濃度的選擇DF-1細胞在DMEM(10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)完全培養液中于5%CO2、37℃條件下培養。當細胞密度約80%時分別加入不同質量濃度的LPS[11](0.0,0.5,2.0,8.0,32.0 mg/L)培養24 h后檢測不同質量濃度組DF-1細胞活力和IL-1β mRNA表達量變化，選擇能引起免疫應激炎癥反應時LPS的最適質量濃度。同樣，將不同質量濃度APS[12](0，20，100，200，500 mg/L)預處理DF-1細胞后，再加入上述最適應用質量濃度的LPS共培養24 h，分別檢測各組IL-1β mRNA表達量變化以及細胞活力(按CCK8試劑盒說明檢測樣品在450 nm處的吸光度)，以確定APS的最適應用質量濃度。

1.4 試驗分組及處理將生長狀態良好的DF-1細胞接種于12孔板(1.25×105/孔)和6孔板(2.5×105/孔)中，待細胞密度約80%時將其分為對照組(C)、LPS組(L)、APS組(A)和APS +LPS組(A+L)共4組，每組設置3個復孔。A組和A+L組首先加入APS，使其終質量濃度為100 mg/L(L組和C組則分別加入相同體積無血清DMEM)預處理2 h。隨后，L組和A+L組加入LPS，使其質量終濃度為2 mg/L(C組和A組則加入相同體積無血清DMEM)，繼續培養6,12,24,48,72 h并收集樣本。

1.5 RT-PCR法檢測NF-κB和MAPK及其通路相關因子mRNA表達量將12孔細胞培養板內的DF-1細胞根據TRIzol使用說明提取總RNA，依據PrimeScriptTMRT試劑盒的說明合成cDNA。用DNAStar與Primer 5.0軟件設計引物，IL-1β、TNF-α、NF-κBp65、p38MAPK、SOCS3和β-actin具體引物序列見表1。β-actin為內參基因，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。各組設置3個復孔，同時設立空白對照。記錄各孔Ct值，并采用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

表1 RT-PCR所用引物序列信息

1.6 ELISA法檢測相關炎性因子蛋白含量在加入LPS后不同時間點，收集各處理組細胞上清液，5 000 r/m離心10 min，去除沉淀，分別按IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒說明書進行相關操作。每個樣本設3個重復，同時設定空白孔。以空白孔調零，測定樣品在450 nm波長時的吸光度。

1.7 Western blot法檢測NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3蛋白含量在加入LPS繼續培養24 h后，棄去6孔細胞培養板內培養液，加入RIPA裂解液(裂解液中含10%PMSF和磷酸酶抑制劑)提取總蛋白，將蛋白煮沸變性后于10% SDS-PAGE凝膠電泳，常規轉印、封閉等操作后在NC膜上分別加入相應濃度的抗NF-κBp65、P-NF-κBp65(Ser 536)、p38MAPK、P-p38MAPK (Thr180/Tyr182)、SOCS 3和α-Tubulin的抗體于4℃孵育過夜，洗滌后再加入HRP偶聯二抗在室溫搖床孵育1 h，后經ECL化學發光處理。

2 結果

2.1 LPS和APS質量濃度的選擇由圖1A可知，LPS質量濃度在0.0～0.5 mg/L時，其質量濃度的增加對DF-1細胞活力稍有增加，但無統計學差異(P>0.05)；當LPS質量濃度在2.0～32.0 mg/L時，DF-1細胞活力顯著降低(P<0.05)，且有劑量依賴性。由圖1B可知，LPS質量濃度在0.5～32.0 mg/L時，DF-1細胞IL-1β mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)，可知在此質量濃度范圍內LPS均可誘導DF-1細胞產生炎癥反應。其中LPS在2.0～32.0 mg/L時炎性因子表達量之間無顯著性差異(P>0.05)，因此確定2.0 mg/L作為本研究LPS最適質量濃度。由圖1D結果發現，在LPS刺激24 h后，APS質量濃度在100～200 mg/L時細胞活力無明顯差異，前者略高于后者，但兩者均顯著高于20，500 mg/L組(P<0.05)；由圖1C可以看出，在LPS刺激24 h后，APS質量濃度在100～500 mg/L時，DF-1細胞IL-1β mRNA表達量顯著低于0～20 mg/L APS組(P<0.05)，且100～200 mg/L組間無顯著性差異(P>0.05)，由此本研究選擇的APS最佳應用質量濃度為100 mg/L。

2.2 不同處理組DF-1細胞IL-1β和TNF-α mRNA表達量的變化結果表明，L組DF-1細胞IL-1β和TNF-α(圖2) mRNA表達量在6～72 h都顯著高于C組(P<0.05)；A組IL-1β和TNF-α mRNA表達量較C組顯著升高(P<0.05)，但不同程度低于L組。與L組相比，A+L組IL-1β和TNF-α mRNA表達量分別在6～72,12～72 h時顯著降低(P<0.05)。

注：*與對照組相比P<0.05；#與LPS組相比P<0.05；無標號者P>0.05。下同

C.對照組；L.LPS組；A.APS組；A+L.APS+LPS組

2.3 不同處理組DF-1細胞NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 mRNA表達量的變化由數據可知，L組NF-κBp65(圖3A)mRNA表達量在LPS刺激后6～72 h時顯著高于C組(P<0.05)；A組NF-κBp65和SOCS3(圖3C)mRNA表達量在6～72 h時均顯著高于C組(P<0.05)。與L組相比，A+L組NF-κBp65 mRNA表達量分別在6～72 h時顯著降低(P<0.05)，SOCS3 mRNA表達量在6～72 h時顯著升高(P<0.05)；其他時間點各因子變化不顯著(P>0.05)。

2.4 不同處理組DF-1細胞IL-1β和TNF-α蛋白含量的變化結果表明，L組DF-1細胞IL-1β(圖4A)和TNF-α(圖4B)蛋白含量在6～72 h時都顯著高于C組(P<0.05)；A組IL-1β和TNF-α蛋白含量較C組顯著升高(P<0.05)，但又不同程度低于L組。與L組相比，A+L組IL-1β和TNF-α蛋白含量分別在12～72,6～72 h時顯著降低(P<0.05)，其他時間點也稍有降低，但統計學上差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同處理組DF-1細胞NF-κBp65(A)、p38MAPK(B)和SOCS3(C)mRNA表達量的變化

圖4 不同處理組DF-1細胞IL-1β(A)和TNF-α(B)蛋白含量的變化

2.5 不同處理組DF-1細胞NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 蛋白含量的變化結果表明，L組和A組DF-1細胞P-NF-κBp65/NF-κBp65(圖5A)比值顯著高于C組(P<0.05)，A+L組P-NF-κBp65/NF-κBp65比值顯著低于L組(P<0.05)；A組SOCS3(圖5C)蛋白含量顯著高于C組(P<0.05)，A+L組SOCS3蛋白含量顯著高于L組(P<0.05)；各處理組間P-p38MAPK/p38MAPK(圖5B)比值變化無統計學差異(P>0.05)。

圖5 不同處理組DF-1細胞P-NF-κBp65/NF-κBp65(A)、P-p38MAPK/p38MAPK(B)和SOCS3/α-Tubulin(C)蛋白含量

3 討 論

APS是黃芪發揮抑炎作用的主要生物活性成分，是從黃芪根部提取并純化的水溶性淡黃色均質粉末，無特殊氣味，不易產生耐藥性，無毒副作用，不影響細胞正常生命活動，可以作為免疫增強劑來提高機體免疫水平，達到預防和治療的雙重作用效果[13]。在體外條件下，APS能促進鼠巨噬細胞活化并誘導大量的炎癥因子如TNF-α、IL-6等的產生，具有免疫調節和抗腫瘤的雙重作用[12]。體內試驗表明，連續灌服不同劑量APS組大鼠抗體生成水平明顯升高，T淋巴細胞亞群失衡現象得到改善，機體免疫水平明顯提高[14]。本研究發現，APS處理組IL-1β和TNF-α在轉錄與翻譯水平都明顯升高，提示APS可通過促進DF-1細胞炎性因子的釋放起到增強免疫的效果。在LPS誘導免疫應激炎癥模型中，LPS與細胞膜表面模式識別受體TLR4結合，通過MyD88依賴途徑直接促進NF-κB入核，進一步加強炎性因子IL-1β和TNF-α等的釋放，進而引起炎癥損傷。研究發現，在LPS刺激的腸上皮細胞炎癥模型中，APS預處理可以顯著降低細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達，這些結果均表明APS作為抗炎藥物在免疫應激類疾病中的可靠用途[15]。在本研究中，APS預處理可以顯著抑制LPS引起的上述損傷作用，表明APS在一定范圍內促進炎性因子產生達到增強機體免疫功能的同時，又可通過某種負反饋調節機制抑制炎性因子的過度表達，進而限制機體的過度炎癥反應。

大量證據表明，NF-κB和p38MAPK參與多種促炎因子的產生與釋放[16-17]。通常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結合處于無活性狀態，只有磷酸化后入核才能發揮相應的免疫功能[18]。本研究發現，APS可以促進DF-1細胞中NF-κBp65炎癥信號的活化，進一步增強下游炎性因子IL-1β和TNF-α的釋放，發揮免疫增強作用。HE等[19]和WEI等[12]研究證實，APS的核心免疫激活結構可與TLR4結合，少量的APS處理可刺激NF-κB的活化，使巨噬細胞釋放大量炎癥因子從而發揮免疫調節作用。而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種免疫細胞內參與炎癥反應、細胞生長、分化等過程。YAO等[20]指出，抑制巨噬細胞中MAPKs的活化可顯著降低細胞中促炎細胞因子的表達。然而在DF-1細胞中，本研究發現各處理組間p38MAPK mRNA的表達以及蛋白磷酸化水平均無顯著性差異，提示在DF-1細胞中由LPS刺激引起的炎癥反應并不通過p38MAPK信號通路，而是主要依賴NF-κBp65信號通路介導，其具體機制仍需進一步探索。

細胞因子信號通路抑制因子(SOCS)蛋白家族是近年來發現的受細胞因子誘導的蛋白質家族，SOCS3 是該家族重要成員之一。SOCS自1997年發現以來一直被認為是JAK/STAT信號通路的負反饋調節蛋白[21]。近年來的研究發現，SOCS蛋白在NF-κB信號通路中發揮著重要的調節作用[22]。有研究表明，在哺乳動物細胞中異常高表達的SOCS3蛋白可通過與TRAF2相互作用抑制NF-κB信號通路的激活，降低促炎因子的產生水平；通過抑制SOCS3的表達，進一步印證了SOCS3蛋白對NF-κB信號通路的抑制作用[23]。本研究中，APS組SOCS3的表達顯著高于對照組，提示APS處理可能通過高表達SOCS3來調節NF-κBp65的活化，使炎性因子IL-1β和TNF-α產生的量既能增強免疫又不至損傷機體；APS+LPS組與LPS組相比，SOCS3的表達顯著升高，NF-κBp65磷酸化水平明顯降低。由此推測，經APS預處理的DF-1細胞再受到LPS刺激時，預先激活的SOCS3可能通過抑制NF-κBp65炎癥信號通路的活化，進一步抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的釋放而發揮抑炎作用，以保護機體免受炎癥損傷。

因此，在DF-1細胞中，APS單獨處理可以促進IL-1β和TNF-α等細胞因子的釋放而發揮免疫增強作用；而在LPS誘導的禽DF-1細胞炎癥模型中，APS預處理能通過SOCS3的高表達來抑制NF-κBp65的過度活化，降低炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，從而發揮抑制炎癥的作用。