小鼠髓過氧化物酶(MPO)基因克隆分析及真核表達載體的構建

甘 澤，王 琪，王媛媛，趙彩英，李怡娜，張全偉，馬友記，張 勇，趙興緒*

(1.甘肅農業大學 動物醫學學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 生命科學與技術學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一種血紅素輔基蛋白酶，屬于血紅素過氧化物酶超家族成員，受生長因子的調控，存在于多種細胞中，參與多種疾病的發生和發展過程。MPO是中性粒細胞產生的具有吞噬功能的溶酶體酶，通過將過氧化氫和氯離子變為次氯酸來參與對外來物質的破壞，可作為中性粒細胞的特異性標記物[1]。正常生理情況下，MPO是先天性免疫系統的一部分，通過介導微生物的殺傷作用來促進宿主防御[2]；在特定條件下，MPO催化產生過多的活性氧觸發氧化應激和氧化性組織損傷[3]，導致多種疾病的發生和發展[4]。活性氧的產生取決于專門的酶，例如還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、MPO和一氧化氮合酶(NOS)等[5]。一氧化氮(NO)可作用于炎癥反應，并在免疫調節反應中起關鍵作用，主要由3種NOS亞型產生：神經元(nNOS)、內皮(eNOS)和誘導型(iNOS)[6]。研究發現，MPO表達水平與其啟動子區域的等位基因多態性有關，在-463位置處(G-463A)的G被A取代后導致MPO轉錄水平顯著降低[7]，在-129位置處(G-129A)也發現G被A取代后MPO轉錄降低的現象[3]。最新研究表明，MPO缺乏癥有較高的發生率[8]，盡管MPO缺乏癥對降低心肌梗塞及其他心血管損傷有保護作用[9]，但MPO缺失后發生嚴重感染和慢性炎癥的幾率明顯增高[9]。但關于MPO介導的神經炎癥和神經元死亡的生化基礎與機理研究仍然是一個未知領域。總之，MPO是一種既與機體免疫防御有關，又與組織氧化損傷有關的復雜的多功能酶，它與臨床疾病的關系已得到越來越多的驗證，隨著對其分子生物學研究的深入，MPO將會有更為廣闊的應用前景。

本研究通過克隆小鼠MPO基因CDS區序列，進行生物信息學分析，為研究MPO生化性質、生物特性和蛋白質結構，及有關信號傳導機制提供理論依據；通過構建MPO真核表達載體并轉染NSC-34細胞，探究細胞內相關基因蛋白的表達變化，為研究MPO在疾病監測和治療中的生物學作用及其水平升高與炎癥和氧化應激之間的聯系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料1640細胞培養基(GE公司，美國)；T4-DNA連接酶、限制性核酸內切酶XhoⅠ和SacⅡ(NEB公司，美國)；TransZol Up和DH5α感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)；高效裂解液RIPA(北京索萊寶公司)；MPO兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；兔源GAPDH多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術有限公司)；Alexa Fluor 633(AF633)標記的羊抗兔紅色熒光二抗(Thermo Fisher公司，美國)；真核表達載體pEGFP-C1(Kanamycin，4 731 bp)購于Clontech公司；小鼠神經元細胞系NSC-34購于上海通派生物科技有限公司。Q6000B微量核酸蛋白測定儀(Quawell公司，美國)；IX71型相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；5417R型高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)；Mini-PROTEAN Tetra Cell 型垂直電泳槽、電轉印槽、梯度PCR儀、凝膠成像系統(Bio-Rad公司，美國)；U2800紫外分光光度計(Hitachi公司，日本)；LightCycler 96 實時熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；LSM800激光共聚焦掃描顯微鏡(CARL ZEISS，德國)等。

1.2 小鼠神經元細胞RNA提取及cDNA合成小鼠神經元細胞于37 ℃、5%CO2條件下使用完全培養基(含10%胎牛血清的1640培養基)培養，待細胞匯合度達90%后，用PBS清洗培養基收集細胞，根據TransZol Up說明書提取細胞RNA，微量核酸測定儀檢測濃度及純度；根據全式金反轉錄說明書將RNA反轉錄為cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.3 設計引物根據NCBI已公布的小鼠MPO(NM_010824.2)、NADPH(AF276957.1)、nNOS(NM_008712.3)和GAPDH(GU214026.1)基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，送由西安擎科生物科技有限公司合成，引物的相關信息見表1。

表1 引物序列及擴增片段長度

1.4 MPO基因克隆及生物信息學分析將MPO基因反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，得到MPO基因的目的條帶，膠回收后連接pUC-57-Kan載體，再轉化 DH5α感受態，在含有卡那霉素抗性(Kan)的固體培養基中培養，挑取單個菌落于液體培養基中擴大培養，并進行菌液 PCR、雙酶切和測序鑒定。

通過NCBI網站BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行同源序列搜索，用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹[10]；采用ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)預測MPO蛋白的基本理化性質[11]；通過DTU Health Tech網站Prediction servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/)在線工具預測MPO蛋白信號肽、跨膜結構域、磷酸化和糖基化位點；運用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測MPO蛋白的二級結構；采用折疊識別建模法通過phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgii?id=index)預測MPO蛋白的三級結構[12]；在網頁PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html) 上進行亞細胞定位預測；運用STRING (https://string-db.org/)構建MPO蛋白的互作網絡[13]。

1.5 pEGFP-C1-MPO表達載體的構建及鑒定將測序正確的pUC-57-Kan-MPO表達載體和pEGFP-C1載體用XhoⅠ和SacⅡ雙酶切，對目的條帶進行膠回收；用T4連接酶將純化的MPO基因與pEGFP-C1載體連接，轉化DH5α感受態細胞，接種于含Kan抗性(100 mg/L)的LB瓊脂平板上，挑選單一陽性克隆的菌斑進行搖菌、過夜培養、提取質粒，并分別進行菌液 PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.6 pEGFP-C1-MPO轉染NSC-34細胞正常培養小鼠神經元細胞NSC-34，當35 mm培養皿中細胞匯合度達到70%～80%時，利用Lipofectamine 2000參考文獻及說明書[14]，將pEGFP-C1和pEGFP-C1-MPO兩種載體進行稀釋，室溫靜置15～20 min 后，均勻滴入培養皿，于37 ℃、5% CO2正常培養，6 h后換2 mL含10%胎牛血清的1640培養液繼續培養，轉染48 h后收集各組培養的細胞進行后續試驗。

1.7 qRT-PCR及Western blot分析提取上述各組細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。選用GAPDH為內參基因，檢測MPO及NADPH、nNOS 基因mRNA的表達水平。結果采用2-△△Ct法進行數據統計分析。

取細胞總蛋白30 μg，通過12% SDS-PAGE分離膠分離，100 V恒壓轉PVDF膜，脫脂牛奶封閉1.5～2.0 h；選用GAPDH作為內參，一抗4 ℃過夜孵育，二抗37 ℃孵育2 h，ECL發光法顯色曝光，運用Image J軟件進行灰度掃描分析。

1.8 細胞免疫熒光染色將細胞接種于蓋玻片，待轉染成功后，置于4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄去固定液，用0.5% Triton X-100室溫孵育10 min，3% H2O2室溫孵育10 min，山羊血清4 ℃封閉15 min，棄去封閉液，滴加一抗(MPO)，4 ℃濕盒孵育過夜；避光滴加AF633紅色熒光標記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，避光滴加二脒基苯基吲哚(DAPI)染核，室溫靜置3～5 min，滴加少量的抗熒光淬滅封片劑封片。

在激光共聚焦顯微鏡下觀察：載體表達的EGFP蛋白顯綠色，DAPI標記的細胞核顯藍色，AF633標記的陽性表達部位顯紅色。

2 結果

2.1 MPO基因克隆將pUC-57-Kan載體與MPO基因擴增產物雙酶切后進行連接，轉化至DH5α感受態細胞后涂板，挑選單一菌落擴大培養。經菌液PCR檢測，得到單一條帶大小約為2 171 bp(圖1A)；對pUC57-T-MPO克隆載體進行XhoⅠ和SacⅡ雙酶切及測序鑒定，雙酶切結果顯示目的片段大小和與預期的大小一致(圖1B)；陽性克隆測序結果與NCBI中序列進行比對，結果相似度達100%；結果表明成功克隆小鼠MPO基因CDS區序列。

2.2 表達載體pEGFP-C1-MPO的鑒定將pUC57-T-MPO克隆載體和pEGFP-C1載體雙酶切，回收目的片段連接空載體，轉化DH5α感受態細胞后涂板，挑選單一菌落進行擴大培養，菌液PCR電泳檢測結果顯示，擴增產物條帶大小為2 171 bp(圖1C)；將pEGFP-C1-MPO表達載體進行XhoⅠ和SacⅡ雙酶切后獲得2條大小分別約為4 700 bp和2 171bp的條帶(圖1D)；結果表明，pEGFP-C1-MPO表達載體構建成功。

M.DNA相對分子質量標準；L1.pUC-57-Kan-MPO菌液PCR產物；L2.pUC-57-Kan-MPO；L3.pUC-57-Kan-MPO雙酶切產物；L4.pEGFP-C1-MPO菌液PCR產物；L5.EGFP-C1-MPO雙酶切產物；L6.pEGFP-C1-MPO

2.3 MPO基因生物信息學分析系統發育樹結果顯示：小鼠MPO基因與章魚、美洲灰熊、馬的親緣關系最為接近，與人、非洲爪蟾、揚子鱷的親緣關系較遠(圖2)。小鼠MPO蛋白氨基酸預測結果表明：小鼠MPO蛋白由718個共19種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)最多(85，11.80%)，組氨酸(His)最少(8，1.11%)；理化性質預測結果表明：小鼠MPO蛋白由11 436個原子組成，相對分子質量為81 181.66，718個氨基酸中帶負電荷氨基酸殘基共60個，正電荷氨基酸殘基共88個，理論等電點為9.63，其不穩定系數為43.53，脂肪系數為85.31，親水性為-0.311，預測該蛋白為不穩定的親水蛋白；信號肽和跨膜結構域預測表明：MPO蛋白無跨膜結構、無信號肽；磷酸化和糖基化位點預測顯示：MPO共有52個磷酸化位點，其中有25個絲氨酸磷酸化位點、6個蘇氨酸磷酸化位點和21個酪氨酸磷酸化位點；蛋白質二級結構的預測結果顯示： 43.61%的α螺旋、5.69%的β折疊、4.72%的β轉角和45.79%的無規卷曲共同構成了MPO蛋白的二級結構；三級結構預測結果顯示：該蛋白有18個α-螺旋，4個β折疊及大部分的無規卷曲構成，這與二級結構預測結果基本一致(圖3A)。亞細胞定位預測結果表明：MPO蛋白在細胞核 (12.9%)、線粒體 (21.7%)、細胞骨架 (13.0%)和細胞質 (52.2%) 中均發揮一定的生物學作用；string結果表明MPO與NADPH、nNOS、TNF、CAT等蛋白存在一定的互作關系(圖3B)。

圖2 不同物種基于MPO的系統進化樹

圖3 MPO蛋白三級結構(A)及MPO蛋白互作關系(B)預測結果

2.4 pEGFP-C1-MPO表達載體瞬時轉染NSC-34細胞pEGFP-C1空載體及pEGFP-C1-MPO表達載體瞬時轉染小鼠NSC-34細胞48 h，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，結果細胞中綠色熒光清晰可見，表明pEGFP-C1空載體與pEGFP-C1-MPO表達載體成功轉入細胞內(圖4)。

2.5 qRT-PCR及Western blot檢測轉染效率利用qRT-PCR對MPO目的基因和GAPDH內參基因進行擴增后，檢測MPO 基因mRNA的表達情況。結果顯示：試驗組MPO基因mRNA的表達水平顯著升高，且與陰性對照組和空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)，而空白對照組與陰性對照組相比MPO基因mRNA的表達水平無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 轉染NSC-34細胞48 h熒光照片(100×)

*.P<0.05；***.P<0.01。下同

Western blot檢驗蛋白表達水平，用GAPDH對小鼠不同組別MPO的表達豐度進行校正，結果顯示：試驗組MPO蛋白的表達豐度明顯上調，極顯著高于陰性對照組(P<0.01)(圖6)，與qRT-PCR的結果一致。

圖6 Western blot檢測MPO蛋白表達水平

2.6 過表達MPO基因后相關基因表達水平的檢測以反轉錄的cDNA為模板，選擇GAPDH為內參基因，以陰性對照組為參照，經qRT-PCR檢測NADPH和nNOS 基因的表達情況。結果表明：試驗組nNOS mRNA表達水平顯著高于陰性對照組(P<0.05)，NADPH mRNA表達水平顯著低于陰性對照組(P<0.05)，表明nNOS 隨MPO表達上調而顯著升高，NADPH隨MPO表達上調而顯著降低(圖7)。

2.7 細胞免疫熒光染色將瞬時轉染pEGFP-C1-MPO和pEGFP-C1載體的NSC-34細胞，通過細胞免疫熒光對小鼠MPO蛋白進行細胞定位檢測。結果表明：轉染pEGFP-C1載體后，MPO蛋白主要分布于細胞質中，而過表達MPO后，除了在細胞質中存在高表達外，在細胞核中也發現MPO蛋白陽性表達(圖8)。

圖7 qRT-PCR檢測NADPH和nNOS mRNA表達水平

3 討論

MPO是一種過氧化物酶，也是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細胞的嗜苯胺藍顆粒中，是髓細胞的特異性標志。隨著對MPO基因研究的深入，人們發現MPO基因的增加或缺失會導致個體對一些疾病易感性的差異，它與人類多種疾病的發生、發展密切相關，因此越來越受到國內外學者的重視。JI等[15]的研究證實MPO基因多態性與患阿爾茨海默氏病(AD)風險的遺傳關聯；NDREPEPA 等[16]強調MPO水平與心血管疾病的患病率和嚴重程度相關。本研究通過對小鼠MPO基因的克隆及生物信息學分析，結果發現：小鼠MPO與章魚、美洲灰熊和馬的親緣關系最為接近，與人、非洲爪蟾和揚子鱷的親緣關系較遠，但氨基酸的同源性都在79.25%以上。胡寶慶等[17]研究表明，在不同物種間MPO存在較高的同源性。綜上說明，MPO基因的核苷酸突變反映在蛋白質水平多屬同義突變，表明在不同物種間MPO基因有較高的保守性，在生物遺傳過程中該基因對于維護機體正常生理功能具有重要的意義[18]。HANSON等[19]與 CARPENA等[20]提出MPO存在4個糖基化位點Asn 323、Asn 355、Asn 391和Asn 483，晶體學數據表明只有3個(Asn 355、Asn 391和Asn 483)；VAN ANTWERPEN等[21]認為除Asn 323、Asn 355、Asn 391和Asn 483這4個之外還有一個Asn 729糖基化位點。本試驗預測出MPO置信度大于0.7的糖基化位點有4個，與 VAN ANTWERPEN等[21]的結果一致。重鏈的糖基化對于MPO的酶促活性很重要，去糖基化的MPO氯化活性顯著降低。蛋白質結構預測結果顯示MPO中主要由無規卷曲構成(45.79%)，其次是α螺旋(43.61%)，而β折疊和β轉角僅占10%左右，α螺旋和β折疊相對較穩定，但含量較少，無規卷曲占比較高使蛋白質分子空間結構相對不穩定[22]，這與通過理化參數計算所得的結果一致[11]。亞細胞定位預測結果表明MPO蛋白主要在細胞質 (52.2%)中發揮生物學作用。免疫熒光結果表明，正常情況下MPO主要分布于細胞質中，但當MPO攜帶一個含有CMV強啟動子的表達載體時，MPO 出現了入核現象，這種現象提示其可能與核膜上的核孔復合體有關并與轉運受體激活相關[23]。蛋白互作發現MPO與NADPH、nNOS、iNOS、TNF和CAT等蛋白存在相互作用關系。大量研究證實[13]MPO與NADPH[24]和nNOS[25]等蛋白存在互作關系，其中MPO、NADPH和nNOS均在Phagosome(ko04145)這一信號通路上。

圖8 免疫熒光檢測MPO在細胞中的分布

為了進一步研究MPO生物學功能，本研究選用pEGFP-C1真核強啟動子表達載體，瞬時轉染NSC-34細胞。結果表明，試驗組綠色熒光表達量低于陰性對照組，推測可能與轉染載體的大小有關(pEGFP-C1-MPO， 6 860 bp；pEGFP-C1， 4 689 bp)，這種現象與戚順民等[26]成功構建H-FABP基因的真核表達載體并轉染PK15細胞的現象一致。轉染結果表明，試驗組MPO mRNA和蛋白表達量極顯著高于陰性對照組，從mRNA轉錄和蛋白表達水平均證明過表達載體pEGFP-C1-MPO構建成功而且有效。MPO蛋白在細胞質中表達便于結合和轉運低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和載脂蛋白A-1[1]等，進而影響各種代謝酶、受體、細胞內信號傳導和基因表達等。研究顯示，MPO主要作為氧化應激和系統炎癥標志物，是預測急性冠狀動脈綜合征(ACS)的新型標志物，對ACS患者的診斷及預測均有較高的價值。MPO其水平增高可以反映中性粒細胞在某一組織中的增高，間接反映炎癥在組織中的存在，MPO活性越高，說明組織炎癥程度越重[3]。炎性狀態下MPO能將亞硝酸鹽氧化成NO2，從而削弱NO2-依賴性血管緊張素的松弛作用并降低鳥苷酸環化酶的活性，在此過程中，一氧化氮(NO)是MPO的一種重要的生理底物，過表達MPO模擬炎癥環境發現這一過程消耗大量的NO，從而誘導合成NO的NOS表達量升高[27]。本研究所用的細胞為小鼠神經元細胞，該細胞中誘導合成NO的NOS為nNOS[6]，即nNOS的表達量升高。有研究報道，NO的合成速度降低或消耗速度加快會導致NO的反應性降低，對NADPH的消耗減少[28]。本試驗中過表達MPO后NO消耗速度增加，從而使NADPH氧化酶的表達量降低。

本研究成功從NSC-34細胞中克隆小鼠MPO基因的CDS區序列，初步預測小鼠MPO蛋白由718個氨基酸組成，其二級結構含43.61%的α螺旋、5.69%的β折疊、4.72%的β轉角和45.79%的無規卷曲，為不穩定的親水性蛋白。pEGFP-C1-MPO表達載體成功轉染NSC-34細胞，結果證實MPO主要表達在細胞質中，MPO 基因體外過表達可促進nNOS表達，抑制NADPH的表達。本研究為MPO基因功能及信號通路的研究提供理論依據。