奶牛維生素E缺乏癥的血液病理學(xué)及其預(yù)警

于泓漪，張翠羽，錢偉東，趙 暢，張洪友，夏 成

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

目前，隨著我國奶牛飼養(yǎng)規(guī)模的不斷擴大，單產(chǎn)量的不斷提高，奶牛維生素E(VE)缺乏的問題越發(fā)嚴重，發(fā)病率可以高達20%以上。VE 又叫做生育酚,是生物體內(nèi)的一種脂溶性維生素，具有多種生物學(xué)功能。它的抗氧化作用最為突出,具有保護細胞及細胞器脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性，維持機體防御機制正常等功能[1]。VE缺乏會引起機體多不飽和脂肪酸(PUFA)過度氧化，細胞膜和溶酶體膜就會受損并釋放出各種溶酶體酶，例如β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶和組織蛋白酶等，導(dǎo)致器官組織的變性等退行性病變[2]。奶牛VE缺乏癥常發(fā)生在圍產(chǎn)期和泌乳早期，VE的缺乏可降低細胞膜的抗氧化能力，尤其降低子宮和乳腺部的中性粒細胞的生物活性，使其易受細菌侵襲，導(dǎo)致胎衣不下、子宮炎和乳腺炎的發(fā)生[3]。然而，由于牛場缺乏有效的快速檢測手段，VE缺乏常難以被發(fā)現(xiàn)而危害奶牛健康。

本試驗針對集約化牛場圍產(chǎn)期奶牛開展圍產(chǎn)期VE缺乏的調(diào)查研究，旨在探究圍產(chǎn)期奶牛VE缺乏與抗氧化、肝功、能量代謝、礦物元素和其他維生素的關(guān)系及其風(fēng)險預(yù)警，為牛場今后泌乳奶牛VE缺乏的早期監(jiān)測和科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組在黑龍江某一大型集約化牛場,選取產(chǎn)前10 d至產(chǎn)后90 d的奶牛，牧場采用阿菲金軟件進行信息管理，應(yīng)用 TMR 全混日糧飼喂，采用集約化散欄式飼養(yǎng)，隨機挑選無病，且年齡、胎次、體況、泌乳量相近的奶牛為試驗對象，根據(jù)血漿VE含量低于2 mg/L為缺乏組，高于4 mg/L為健康組對照組，每組40頭。對試驗?zāi)膛Ｇ宄靠崭惯M行尾跟靜脈采集血液10 mL，用肝素抗凝，立即以4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于EP管內(nèi)，放于-80℃冰箱內(nèi)凍存待檢。

1.2 檢測項目VE(mg/L，液相色譜法)，總抗氧化能力(T-AOC，mmol/L，微量法)，丙二醛(MDA，mmol/L，微量法)，超氧化物歧化酶(SOD，U/mL，微量法)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，U/mL，微量法)，過氧化氫酶(CAT，U/mL，微量法)，β-羥丁酸(BHBA，mmol/L，生化分析儀)，游離脂肪酸(NEFA，μmol/L，微量法)，葡萄糖(GLU，mmol/L，生化分析儀)，總膽固醇(TC，mmol/L，生化分析儀)，肌酐(CREA，mmol/L，生化分析儀)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，U/L，生化分析儀)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，U/L，生化分析儀)，低密度脂蛋白(LDL，mmol/L，生化分析儀)，高密度脂蛋白(HDL，mmol/L，生化分析儀)，白蛋白(ALB，g/L，生化分析儀)。

1.3 統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0軟件的獨立樣本t檢驗對檢測指標進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示，閾值P設(shè)為0.05。使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 VE缺乏對試驗牛抗氧化功能的影響由表1所示，與健康組相比，VE缺乏組血漿T-AOC含量極顯著降低(P<0.01),MDA和CAT含量極顯著升高(P<0.01)。

2.2 VE與氧化應(yīng)激指標的相關(guān)性分析由Pearson相關(guān)性分析(表2)可知，T-AOC與VE水平呈極顯著正相關(guān)，MDA和CAT與VE水平呈極顯著負相關(guān)。

表2 VE與抗氧化指標的相關(guān)性

2.3 VE缺乏對試驗牛肝功的影響由表3所示，與健康組相比，缺乏組血漿ALT含量顯著升高(P<0.05)，AST、LDL含量極顯著升高(P<0.01)，而ALB、HDL含量極顯著降低(P<0.01)。

表3 試驗?zāi)膛８喂顩r

2.4 VE與肝功指標的相關(guān)性分析由Pearson相關(guān)性分析(表4)可知，血漿中ALT與VE水平呈顯著負相關(guān)，AST和LDL與VE水平呈極顯著負相關(guān)，HDL和ALB與VE水平呈極顯著正相關(guān)。

表4 VE與肝功指標的相關(guān)性

2.5 VE缺乏對試驗牛能量代謝的影響由表5所示，與健康組相比，缺乏組血漿BHBA含量顯著增高(P<0.05),NEFA和CREA含量極顯著增高(P<0.01)。

表5 試驗?zāi)膛Ｄ芰看x狀況

2.6 VE與能量代謝指標的相關(guān)性分析由Pearson相關(guān)性分析(表6)可知，血漿中NEFA和CREA與VE水平呈極顯著負相關(guān)。

表6 VE與能量代謝指標的相關(guān)性

2.7 泌乳奶牛VE缺乏的風(fēng)險預(yù)測表7顯示了奶牛VE缺乏的分界值、敏感度、特異度、標準誤、陽性似然比(+LR)和ROC曲線下面積(AUC)。根據(jù)ROC分析結(jié)果(圖1)可知，血漿中HDL、T-AOC、LDL、ALB、MDA、AST和NEFA的曲線下面積依次分別為0.835，0.820，0.807，0.783，0.755，0.741和0.736，可作為VE缺乏的良好的預(yù)警指標，其預(yù)警閾值分別為HDL<1.495 mmol/L，T-AOC<0.305 mmol/L，LDL>4.09 mmol/L，ALB<51.70 g/L，MDA>11.19 mmol/L，AST>37.20 U/L和NEFA>713.00 μmol/L。

圖1 ROC曲線

3 討論

3.1 VE缺乏對奶牛抗氧化功能的影響在正常情況下，奶牛機體的抗氧化能力和氧化能力一直處于一個相對平衡的狀態(tài)，然而在圍產(chǎn)期，奶牛對能量的需求急劇增加，但攝入的能量不能滿足奶牛所需，這就會使奶牛產(chǎn)生能量負平衡(NEB)。目前普遍認為，能量負平衡是圍產(chǎn)期奶牛機體免疫力低下和泌乳早期氧化應(yīng)激的主要病因，并且VE缺乏會加重它們對機體健康的危害[4-7]。

本試驗VE缺乏組奶牛血液中MDA的含量顯著升高，與VE呈負相關(guān)；CAT的含量與VE呈現(xiàn)負相關(guān)；VE與T-AOC呈極顯著正相關(guān)。由于MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此在發(fā)生氧化應(yīng)激時，過多的自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA[8]。CAT參與動物機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。蛋白羰基和蛋白氧化產(chǎn)物是體內(nèi)氧化應(yīng)激的標志，運動導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加[9]。總抗氧化能力(T-AOC)代表整個機體防御體系的抗氧化能力。本試驗中在奶牛體內(nèi)VE減少時，氧化應(yīng)激加重，機體調(diào)動CAT和T-AOC來減緩氧化應(yīng)激。因此，VE缺乏時奶牛機體通過酶促和非酶促兩個系統(tǒng)來增強抗氧化能力。

表7 分界值、敏感度、特異度、標準誤、陽性似然比和ROC曲線下面積

3.2 VE缺乏對奶牛肝功的影響肝臟是維持動物機體健康的最重要的器官。本試驗中VE缺乏組奶牛ALT和AST含量顯著升高。當AST和ALT都升高，表示肝臟受損[10]。血液ALB是肝功的重要指標，也是機體蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況的標志。ALB濃度與日糧蛋白質(zhì)有關(guān)，當ALB濃度降低時，表明機體缺乏蛋白質(zhì)，或肝臟白蛋白合成降低。白蛋白和球蛋白通過相互補償?shù)姆绞絹砭S持總蛋白的恒定水平[11]。

在本試驗中，VE缺乏組LDL含量極顯著升高，HDL含量極顯著降低，并且LDL與VE呈極顯著負相關(guān)，HDL與VE呈極顯著正相關(guān)。VE是循環(huán)及細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要保護劑，它能有效降低脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，防止載脂蛋白B和脂蛋白A的氧化降解，從而有利于肝臟及外周組織VLDL和HDL的分泌， 減少高膽固醇血癥和糖尿病病人F2-異前列腺素的分泌[12]。

3.3 VE缺乏對試驗?zāi)膛Ｄ芰看x的影響氧化應(yīng)激與高NEFA、BHBA血癥密切相關(guān)[13]。當血清中BHBA的濃度≥3.0 mmol/L時可確定為臨床酮病[14]，BHBA的濃度在1.2～2.9 mmol/L時可確定為亞臨床酮病[15]。NEFA可通過降低抗氧化酶的活性來促進氧化應(yīng)激的發(fā)生[16]。本試驗VE缺乏組奶牛BHBA含量高于1.2 mmol/L，提示VE缺乏與奶牛亞臨床酮病有關(guān)。

本試驗結(jié)果中酮病奶牛血液中CREA含量顯著升高，提示酮病奶牛肌肉代謝增強，與補償機體對能量需求增高有關(guān)。王楓等[17]報道VE可以降低血漿總膽固醇的含量，這與本試驗研究結(jié)果一致。

3.4 VE缺乏的初步預(yù)警本研究通過Spearman相關(guān)分析、二元Logistic回歸和ROC分析界定了牛場VE缺乏癥的預(yù)警值。血漿中HDL水平不應(yīng)超過1.495 mmol/L，T-ACO水平不應(yīng)超過0.305 mmol/L，LDL水平不應(yīng)低于4.09 mmol/L，ALB水平不應(yīng)超過51.70 g/L，MDA水平不應(yīng)低于11.19 mmol/L，AST水平不應(yīng)低于37.20 U/L，NEFA水平不應(yīng)低于713.00 μmol/L。對應(yīng)的敏感度分別是100.0%,57.5%,97.5%,82.5%,95.0%,77.5%,80.0%，對應(yīng)的ROC曲線下面積均大于0.5，具有診斷意義。其中HDL、LDL和T-AOC的ROC曲線下面積大于0.8，可作為主要預(yù)警指標，其他指標作為輔助指標。

綜上所述，奶牛產(chǎn)后VE缺乏會促進氧化應(yīng)激，與奶牛亞臨床酮病有關(guān)，并對肝功造成了影響。確立了HDL、T-AOC、ALB、LDL、AST、NEFA和MDA可作為VE缺乏癥的預(yù)警指標及其預(yù)警值。