慢性冷熱應激對放牧西門塔爾牛抗氧化功能及HPA軸、SAM軸激素分泌的影響

陳 浩，敖日格樂，王純潔，斯木吉德，超 克，劉 波

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

應激是動物機體對各種刺激所產生的非特異性應答反應的總和，根據應激源的不同可分為熱應激、冷應激、運輸應激及斷奶應激等[1]。目前，因環境溫度的變化所引起的冷熱應激常導致畜禽在實際生產中出現繁殖力降低、生產性能下降及免疫功能降低等問題，這嚴重制約了我國畜牧業的健康快速發展[2-4]。當動物所處環境溫度大于等熱區中的舒適區的上限時將引起動物產生熱應激，可通過動物機體自身的生理指標如直腸溫度和呼吸頻率來判定奶牛是否處于熱應激狀態。溫濕指數(THI)作為綜合環境溫度和濕度的外界環境參數也能判斷動物是否處于熱應激狀態，有研究指出當THI大于72時，奶牛處于熱應激狀態[5]。目前關于冷應激的研究主要集中于冷應激對動物機體所產生的影響，并無明確定義，有研究報道在無風環境下，溫度下降至-6.8℃ 時歐洲牛處于冷應激狀態[6]。由溫度刺激引起的冷熱應激可根據應激持續時間分為急性和慢性，其中急性冷熱應激是指機體短時間處于高溫或低溫環境，慢性冷熱應激通常是由于季節變化導致機體長時間處于高溫或低溫環境，機體已經暫時適應環境之后的冷熱應激狀態，無論是急性還是慢性冷熱應激都會對畜禽的生理功能和營養代謝等造成一定影響，并給畜牧業帶來巨大的經濟損失[7]。

應激可導致機體抗氧化酶系統受損，大量自由基無法被及時清除而堆積引起機體氧化-抗氧化失衡，機體發生氧化應激反應進而引起疾病的發生[8]。鐘光等[9]報道，持續熱應激顯著降低了黃羽肉雞血清中SOD及肝臟中GSH-Px活性；張燕等[10]研究發現冷應激狀態下荷斯坦奶牛血清中MDA含量顯著增多；近年來，有大量研究報道，熱應激可降低綿羊和山羊血清中SOD和T-AOC活性，導致動物機體抗氧化功能受損進而誘導機體產生氧化應激[11-13]。當動物處于冷熱應激狀態時，可通過降低或增加呼吸頻率從而有效減少或增加呼吸排出的熱量。蔡明成[14]的研究表明，熱應激狀態下肉牛的呼吸頻率增加了17.6次/min；王祖新等[15]研究發現低溫可顯著降低奶牛的呼吸頻率。腎上腺是對環境溫度極其敏感的動物機體內分泌腺，去除腎上腺的動物在遭受過強應激時易衰竭死亡[16]。有研究指出，仔豬血清中ACTH含量隨著冷應激持續時間的延長而升高[17]。應激可使機體交感神經興奮，井霞[18]研究發現冷熱應激可顯著提高荷斯坦奶牛血清中EPI含量以提高機體的抗應激能力。目前，國內外關于冷熱應激的研究較少，放牧環境下肉牛冷熱應激相關研究鮮有報道。因此，本研究擬以放牧西門塔爾牛為試驗群體，探討慢性冷應激對放牧西門塔爾牛抗氧化功能和HPA軸、SAM軸激素分泌的影響，旨在為放牧牛抗冷熱應激、抗病及冷熱應激相關研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理以內蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某家庭牧場提供的60頭體質健康、體質量相近的西門塔爾牛為試驗動物。試驗牛群飼養管理一致，采用散欄式飼養，日糧公司統一配制，每日早和晚飼喂2次，自由飲水。

1.2 試驗時間及地點試驗在內蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某家庭牧場進行。試驗分3個階段進行：春季(2018年4月)、夏季(2018年6月)和冬季(2017年12月)。

1.3 環境溫濕度測定由于試驗是以在天然草場進行全年放牧的肉牛為研究對象， 所以所測的環境指標均為自然環境下的溫度、相對濕度和風速。試驗期間， 測定每天8:00、14:00以及20:00的天然放牧草場的溫度和相對濕度， 并監測計算試驗當月的平均風速和日照時間。

1.4 血樣采集在試驗期最后一天清晨對每頭試驗牛進行頸靜脈采血。采用非抗凝采血管采集10 mL 血液，靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，分離制備血清，分離的血清立即置于液氮中帶回實驗室，保存于-80℃冰箱中用以測定血液生化指標。

1.5 生理指標及血液指標測定試驗期間，測定每日8:00、14:00和20:00時試驗牛的呼吸頻率和直腸溫度。呼吸頻率:觀察試驗牛安靜休息時胸廓及腹部的運動，用秒表計時器連續測定10 min。直腸溫度：用獸用體溫計測定。

血清中促腎上腺皮質激素(ACTH)、胰高血糖素(GC)、去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(EPI)含量測定采用酶聯免疫分析法，試劑盒均購自北京華英生物技術研究所，測定方法按照試劑盒說明書進行操作。血清中丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用酶聯免疫分析法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定方法按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 不同季節放牧草場溫濕度及綜合指數(CCI )不同季節牛舍溫濕度及CCI的測定結果見表1。在各試驗階段中，草場上平均溫度夏季最高為27.70℃，其次是春季為13.80℃，冬季最低，為-15.49℃；平均相對濕度夏季最高為69.40%，其次是春季為57.70%，冬季最低為31.50%；平均CCI值夏季最高為28.40，其次是春季為14.90，冬季最低為-9.70 。

2.2 不同季節放牧西門塔爾牛直腸溫度及呼吸頻率的測定結果不同季節西門塔爾牛生理指標的測定結果見表2。結果顯示，試驗牛的呼吸頻率及直腸溫度夏季最高，冬季最低。春季直腸溫度及呼吸頻率分別為38.26℃和28.11次/min，均處于正常水平。直腸溫度及呼吸頻率夏季顯著高于春季和冬季(P<0.05)，春季顯著高于冬季(P<0.05)。

表1 不同季節牛舍溫濕度及CCI

表2 不同季節西門塔爾牛直腸溫度及呼吸頻率

2.3 不同季節西門塔爾牛血清抗氧化指標的變化不同季節西門塔爾牛血清抗氧化指標變化如表3所示。結果顯示，試驗牛血清中MDA含量夏季和冬季均顯著高于春季(P<0.05)，夏季與冬季之間差異不顯著(P>0.05)；T-AOC含量春季與夏季顯著高于冬季(P<0.05)，夏季與春季之間差異不顯著(P>0.05)；GSH-Px含量在3個季節之間差異不顯著(P>0.05)；SOD含量春季顯著高于夏季和冬季(P<0.05)，且冬季顯著高于夏季(P<0.05)。

表3 西門塔爾牛血清抗氧化相關指標

2.4 不同季節西門塔爾牛血清中HPA及SAM軸激素分泌變化不同季節西門塔爾牛血清中的HPA及HPT軸激素分泌測定結果見表4。結果顯示，西門塔爾牛血清中ACTH、GC、GCG、GLU含量冬季顯著高于夏季和春季(P<0.05)，春季顯著高于夏季(P<0.05)；NE含量夏季和冬季均顯著高于春季(P<0.05)，夏季與冬季之間差異不顯著(P>0.05)；EPI含量夏季和冬季均顯著高于春季(P<0.05)，冬季顯著高于夏季(P<0.05)；INS含量夏季顯著高于冬季和春季(P<0.05)，春季顯著高于冬季(P<0.05)。

表4 西門塔爾牛血清中HPA軸及SAM軸激素水平

3 討論

3.1 慢性冷熱應激對西門塔爾牛直腸溫度及呼吸頻率的影響肉牛熱應激是由環境溫度、濕度、空氣對流及自身產熱等多種因素引起的，其中環境溫濕度是最主要的影響因素，因此綜合了環境溫濕度、風速及日照時間的CCI是判斷放牧條件下肉牛是否遭受熱應激的重要指標[19]。一般認為當CCI大于25時肉牛處于熱應激狀態,小于0時處于冷應激狀態；奶牛最適宜溫度為-0.5～20.0℃，肉牛生長適宜溫度是5～25℃[20-22]。本試驗研究結果顯示，春季試驗期牧場平均溫度為13.80℃，CCI為14.90，均未達到牛產生熱應激的臨界值；夏季試驗期草場平均溫度為27.70℃，CCI達到28.40，已超出牛產生熱應激的臨界值，試驗牛處于熱應激狀態；冬季試驗期，草場平均溫度為-15.49℃，最低氣溫至-21.40℃，遠低于奶牛泌乳和肉牛生長的適宜溫度，因此試驗牛在冬季遭受冷應激。本試驗因此根據冷熱應激反應的持續時間，判定春季試驗期為非冷熱應激期，冬季和夏季為慢性冷熱應激期。

熱應激刺激機體引起交感神經興奮進而導致體溫升高，機體通過增加呼吸頻率以加快散熱；而當動物處于冷應激狀態時，機體最主要的生理反應是通過自主神經和神經內分泌雙重調節增加產熱以維持恒定體溫[23-24]。奶牛安靜狀態下呼吸頻率為18～28次/min，正常體溫為38.00～39.17℃[25]。SRIKANDAKUMAR[26]等和CORREA-CALDERON等[27]研究發現，熱應激狀態下荷斯坦奶牛的呼吸頻率和直腸溫度均極顯著升高(P<0.01)。BERMAN等[28]的研究結果顯示，當牛舍溫度超過25℃時，荷斯坦奶牛的呼吸頻率上升到50～60次/min。魏學良等[29]報道，在6-9月份奶牛的呼吸頻率和直腸溫度顯著高于3-5月份(P<0.05)，10月份至來年2月份奶牛的呼吸頻率和直腸溫度顯著低于3-5月份。本試驗研究發現，西門塔爾牛呼吸頻率和直腸溫度在春季處于正常范圍內，冬季顯著低于春季且夏季顯著高于春季，這表明在遭受熱應激刺激時，西門塔爾牛通過增加呼吸頻率以加快機體散熱，但是當通過增加呼吸頻率無法調節時，則表現為直腸溫度升高；隨著冷應激持續時間的延長，西門塔爾牛通過自身調節可能無法有效緩解寒冷應激，其直腸溫度和呼吸頻率顯著低于非冷熱應激狀態下的水平。

3.2 慢性冷熱應激對西門塔爾牛抗氧化功能的影響動物在正常生長代謝過程中會產生含氧自由基，若不能被及時清除，體內積累的自由基可通過破壞細胞的結構和功能，使生物膜中的不飽和脂類發生脂質過氧化并形成脂質過氧化物，其最終產物即是MDA[30]。動物機體自身具有廣泛的抗氧化防御機制，哺乳動物體內抗氧化防御機制包括酶促體系和非酶促體系兩大抗氧化防御體系，酶促體系中的主要抗氧化酶有T-AOC、GSH-Px及SOD[31]。GSH-Px可通過清除體內過多的自由基以抑制機體脂質過氧化；SOD是機體內一種重要的抗氧化酶，在清除自由基和防止生物大分子損傷等方面具有重要作用；T-AOC代表機體防御體系的抗氧化能力[32-34]。由于抗氧化酶系統不斷地清除體內產生的自由基，從而保護機體在正常生長代謝過程中免受氧化應激損傷。

當動物遭受應激時，其抗氧化酶系統平衡被打破，機體需耗費大量的抗氧化酶來消除過多的自由基[35]。王玲等[36]研究發現，夏季肉牛血清中T-AOC、GSH-Px及SOD活性較春季顯著降低，MDA含量極顯著升高(P<0.01)。楊篤寶等[37]通過研究熱應激對荷斯坦奶牛的影響，也進行了類似的報道。吳秀群等[38]報道熱應激狀態下，奶牛血清中MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px活性極顯著(P<0.01)和顯著下降。本試驗研究發現，熱應激狀態下西門塔爾牛血清中MDA含量相較于非應激狀態顯著升高，T-AOC和SOD活性顯著降低。由于熱應激可以導致動物內臟組織缺氧進而誘導自由基的產生量增加。為清除體內產生的過多自由基，西門塔爾牛血清中SOD被大量消耗，進而加快機體組織的脂質過氧化，導致其終產物MDA含量同樣顯著升高，西門塔爾牛體內抗氧化酶系統平衡因此被打破，導致其T-AOC顯著下降，這些均表明慢性熱應激對西門塔爾牛機體造成了一定的氧化損傷。近年來，大量研究表明，冷應激能夠對雛雞、大鼠及蛋鴨造成氧化損傷[39,40-41]。張燕等[10]研究發現，冷應激使荷斯坦奶牛血清中T-SOD和CuZn-SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高。孟祥坤等[42]報道，在舍內平均溫度為-4.0℃時，西門塔爾雜交犢牛血清中SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高。本試驗研究發現，冷應激狀態下西門塔爾牛血清中MDA含量顯著高于非應激狀態，T-AOC含量有升高的趨勢，SOD活性顯著下降，但GSH-Px活性無顯著變化。這可能是由于冷應激破壞了西門塔爾牛體內抗氧化酶系統平衡，導致自由基產生過量，MDA含量顯著升高，為清除體內過量的自由基而SOD被大量消耗導致其活性下降；冷應激狀態下西門塔爾牛血清中T-AOC含量相較于非應激狀態有升高的趨勢，可能是隨著冷應激持續時間的延長，西門塔爾牛機體逐漸適應低溫環境，導致T-AOC代償性升高，進一步保護機體免受氧化損傷，但其代償性升高的作用機制有必要進行深入研究。

3.3 慢性冷熱應激對西門塔爾牛HPA軸及SAM軸激素分泌的影響機體內分泌系統通過多種激素調控機體的生理機能以維持內環境的恒定，當動物受到外界刺激產生應激時，機體SAM軸被激活，引起交感神經興奮進而刺激腎上腺髓質增強合成及釋放NE、EPI及DA，以提高機體對應激的適應能力[43]。NE是由腎上腺髓質神經末梢釋放的神經遞質，其分泌量隨交感神經興奮的增強而增加。EPI是一種由腎上腺釋放的激素，其含量的變化與HPA軸激活與否相關[44]。當SAM軸不能有效調節機體應激時，HPA軸將被激活，HPA軸激素適度分泌有利于機體抵抗應激，但持續被激活HPA軸的動物將處于亞病理狀態，嚴重時可導致動物產生病理變化[45]。冷熱應激激活HPA軸，下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)促使垂體分泌ACTH進而激活腎上腺皮質分泌和釋放GC，GC通過負反饋調節垂體分泌ACTH。ACTH的主要生理功能是促進腎上腺皮質發育并調控GC的合成與分泌。腎上腺是動物體內對溫度較敏感的內分泌腺，去除腎上腺的動物抗應激能力顯著下降，遭受強烈應激時易衰竭死亡[46]。有研究發現高溫環境可引起腎上腺交感神經興奮，促進EPI分泌增加進而升高GLU；近年來，對小鼠的冷應激相關研究表明，冷應激狀態下小鼠的HPA和SAM軸被激活進而促進ACTH的分泌[47-48]。胡麗蓉等[49]通過研究冷熱應激對荷斯坦奶牛血液生化指標的影響，結果表明與非應激狀態相比，熱應激狀態下奶牛血清中NE含量極顯著下降，冷應激狀態下ACTH含量分別呈顯著下降和極顯著下降(P<0.05)。呂曉偉[6]研究發現，冷熱應激狀態下泌乳奶牛血清中EPI含量相較于非應激狀態分別升高了7.61和5.63倍，這表明在冷熱應激期間SAM軸起著重要作用。GC主要調控動物機體的內分泌及代謝以維持內環境的穩定，可增強肝糖原異生和糖原貯備；GCG可利用自身較強的糖異生和分解作用引起GLU升高；INS可通過調節GLU在機體內的合成和轉化作用以維持血糖穩定[50]。有研究報道熱應激狀態下奶牛血液中INS濃度顯著降低[51]。但ITOH[52]研究發現，熱應激顯著提高了泌乳奶牛血清中INS濃度，并降低GC濃度。本試驗研究結果表明，與非應激狀態相比，冷應激狀態下西門塔爾牛血清中ACTH、GC、NE、GCG和GLU含量均顯著升高，INS水平顯著降低，EPI含量差異不顯著；與非應激狀態相比，熱應激狀態下西門塔爾牛血清中ACTH、GC、GCG和GLU含量顯著下降，INS含量顯著升高，NE和EPI含量差異不顯著。 這表明在冷應激時，西門塔爾牛SAM軸迅速被激活引起交感神經興奮， NE分泌增多，進而導致GCG的糖原分解作用增強，GLU含量升高為機體提供能量，以提高牛機體應對低溫應激的能力，且由于冷應激持續時間較長，西門塔爾牛HPA系統被激活，ACTH含量升高引起GC分泌增多，GC主要功能是增強糖異生進而升高血糖為機體提供能量，最終提高西門塔爾牛的抗寒能力；熱應激期間，GLU含量下降可能是由于西門塔爾牛機體利用GLU供能以加快外周循環增強散熱，隨著熱應激持續時間延長，西門塔爾牛HPA軸被激活，引起GC分泌量增加，GC對下丘腦和垂體前葉具有負反饋抑制作用，可能通過負反饋抑制作用降低了ACTH分泌量，但其具體作用機制需進行下一步深入研究。

總之，冷熱應激對內蒙古錫林郭勒草原放牧西門塔爾牛的正常生理指標均產生了顯著影響，機體通過神經內分泌系統的HPA軸及SAM軸分泌的主要激素調節生理功能以維持內環境穩定。冷熱應激狀態下西門塔爾牛組織細胞遭受損傷，導致體內自由基蓄積過多，血清中MDA含量顯著升高，T-AOC和SOD活性顯著下降，體內抗氧化酶系統遭受破壞。