西藏部分地區牦牛源肺炎克雷伯菌的分離、鑒定、毒力及耐藥基因分析

貢 嘎，格桑卓瑪，左 偉，羅潤波，索朗斯珠*

(1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2．西藏自治區動物疫病預防控制中心，西藏 拉薩 850000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)屬于腸桿菌科克雷伯桿菌屬，不僅廣泛存在于自然界中，在人和動物的消化道、呼吸道和皮膚等部位均有分布，主要使人和動物引發肺炎、細菌性肝膿腫、泌尿系統感染、敗血癥和外傷性感染等[1-3]。

目前，肺炎克雷伯菌已成為除大腸桿菌外的第二大條件致病菌。在我國臺灣地區及其他多個國家，由肺炎克雷伯菌引發的化膿性肝膿腫并發眼內炎或腦膜炎頻繁發生[4-7]。據報道，該菌毒力因子主要有K抗原(莢膜多糖)、脂多糖(O 抗原脂多糖)和Ⅰ型菌毛等[8-12]，且莢膜多糖是重要的毒力因子之一。迄今為止肺炎克雷伯菌存在至少82 種莢膜多糖血清型[13-14]，其中K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57 和 KN1 被認為是強毒力血清型[15-16]。

牛感染此菌主要引起牛上呼吸道感染和奶牛乳房炎等。在國外，KATSANDE等[17]和ASLAN等[18]報道,肺炎克雷伯菌在奶牛乳腺炎和牛上呼吸道感染細菌病原中分別占15.5%，20.0%；在國內，許惠[19]2012年證實肺炎克雷伯菌可引起牛發病，且表現出嚴重的呼吸道感染癥狀及重癥肺炎等。隨后，王樂等[20]和葛東紅等[21]報道陜西、江蘇等地都有肺炎克雷伯菌在奶牛中流行。刀麗梅等[22]報道，牛源肺炎克雷伯菌在重慶和四川地區流行。隋明等[23]在2019年對四川地區牦牛源肺炎克雷伯菌進行了分離鑒定及耐藥性分析。西藏是我國五大牧區之一，牦牛是主要的支柱產業之一，其提供的產品對當地牧民的衣食住行等方面起著重要的作用。隨著牦牛養殖數量的增加，關于牦牛相關疾病的報道逐漸增多。但目前尚未見有關西藏牦牛源肺炎克雷伯菌的報道。本試驗從西藏拉薩市、林芝市、那曲市等不同牦牛養殖戶采集了103 份患呼吸道疾病牦牛鼻拭子樣品，分離鑒定肺炎克雷伯菌，并對其進行莢膜血清分型、毒力基因、耐藥表型和耐藥基因的檢測，為牦牛源肺炎克雷伯菌的進一步研究及防制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集從西藏拉薩市、林芝市、那曲市牦牛養殖戶采集患有呼吸道疾病牦牛鼻拭子103 份樣品(其中拉薩市30 份、那曲市30 份、林芝市43 份)進行細菌分離鑒定。患病牦牛均出現呼吸急促、食欲減退、咳嗽等癥狀，并有大量的膿性鼻分泌物。

1.2 實驗動物5周齡SPF級BALB/c小鼠10 只，購自北京維通利華實驗動物中心，體質量約17 g。

1.3 主要試劑哥倫比亞血平板購自江門市凱林貿易有限公司；胎牛血清購自青島中創生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、核酸染料Gel View、克隆載體pMD18-T等購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、LB培養基均購自上海生工。

1.4 藥敏紙片青霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松、新霉素、苯唑西林、四環素、氨芐西林、多西環素、慶大霉素、米諾環素、哌拉西林、卡那霉素、紅霉素、環丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星藥敏紙片，共13 種，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.5 細菌的分離培養及純培養將鼻拭子劃線接種于哥倫比亞血平板上，37℃培養18～24 h，觀察細菌生長情況，挑取單個菌落進行純培養。

1.6 分離菌的生化鑒定挑取純培養單菌落，制備菌株懸液，并利用細菌微量生化鑒定管進行生化鑒定。

1.7 動物致病性試驗選取所分離獲得的牦牛源克雷伯菌菌株，接種營養肉湯培養基，37℃振蕩培養24～48 h，4 000 r/min離心20 min，用滅菌生理鹽水調整含菌量為104CFU/mL的懸浮液，作為攻毒用菌液。分別以0.2 mL/只腹腔接種試驗小鼠5只，同時以相同劑量營養肉湯按相同途徑接種試驗小鼠5只作為空白對照，接種后隔離飼養觀察，記錄試驗小鼠死亡情況。剖檢觀察死亡小鼠組織病變，并從死亡小鼠組織中分離回收攻毒菌。

1.8 16S rDNA及系統發育樹的構建提取細菌基因組DNA，根據文獻[20]中報道的16S rDNA通用引物，進行PCR鑒定，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的基因進行克隆；PCR檢測陽性的菌液送去測序，測序結果用NCBI數據庫進行BLAST比對。選取部分序列，采用MEGA 7.0法構建系統進化樹。

1.9 特異性基因鑒定根據文獻[20]中報道的肺炎克雷伯菌特異性引物：5′-TGATTGCATTCGCC-ACTGG-3′；5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′，進行PCR擴增，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 K血清型PCR檢測選擇流行廣泛的莢膜血清型，參考文獻[24]采用PCR擴增方法對分離株進行分型檢測，引物序列見表1。

表1 血清分型PCR引物參數

1.11 毒力基因檢測選擇文獻中報道較多且與其致病性關系密切的毒力基因mrkD、fimH和wabG，參考文獻[25]采用PCR擴增的方法進行檢測，引物序列見表2。

表2 毒力基因PCR引物參數

1.12 耐藥基因檢測選擇6類16種耐藥基因，參考文獻[26]采用PCR擴增方法進行檢測，引物序列見表3。

表3 耐藥基因引物參數

續表3

1.13 藥敏試驗無菌操作選取分離細菌純培養物致密劃線于普通營養瓊脂平板上，將臨床常用的16種抗生素藥敏紙片貼于瓊脂平板表面中央處，倒置平皿，放于37℃培養箱中培養24 h 后觀察結果。參照 NCCLS(2013)公布的標準以敏感(susceptible)、中介(intermediate)和耐藥(resistant)3種形式對抑菌圈直徑大小做出判定，個別抑菌圈直徑大小參考相關文獻做出判定[27]。

2 結果

2.1 細菌的分離純化從所采集的103 份樣品中，分離到8 株疑似肺炎克雷伯菌株。分離菌株在哥倫比亞血平板血瓊脂培養基上形成光滑、濕潤、邊緣整齊黏液狀菌落。革蘭染色后鏡檢為G-(圖1)。

圖1 分離菌革蘭染色鏡檢結果

2.2 生化鑒定結果8株分離菌株能發酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、鼠李糖、海藻糖，甘露醇、阿拉伯醇、山梨醇、吲哚呈陽性，而肌醇、精氨酸雙水解酶呈陰性，不產生H2S，與肺炎克雷伯菌生化特性基本一致，均疑似為肺炎克雷伯菌。

2.3 動物致病性試驗將分離的菌株制成懸浮液，腹腔接種試驗小鼠，結果從接種后3 d開始，試驗小鼠出現死亡現象，且病死率達80%(4/5)。對死亡小鼠進行尸檢發現，其脾臟具有明顯的腫大現象。并且成功從死亡小鼠脾臟中分離到克雷伯菌，經PCR鑒定與所分離出的菌株與攻毒菌株一致。對照組小鼠仍存活。

2.4 16S rDNA及系統發育樹的構建采用PCR方法進行16S rDNA檢測，擴增出約1 400 bp條帶，與目標條帶片段大小一致，鑒定結果見圖2。不同地區肺炎克雷伯菌檢出率結果見圖3，總檢出率7.76%(8/103)，其中拉薩市檢出率0.00%(0/30)，那曲市檢出率6.67%(2/30)，林芝市檢出率最高達13.90%(6/43)。對測序結果進行比對后構建進化樹，結果西藏牦牛源分離菌株與重慶牛源KM096433和北京土壤源JQ003560聚為一簇，表明與KM096433和JQ003560親緣關系最近,但與沃爾巴克菌不在同一分支上，結果見圖4。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.樣品編號

圖3 不同地區肺炎克雷伯菌檢出率

圖4 牦牛源肺炎克雷菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹

2.5 特異性基因(Khe)鑒定采用PCR方法檢測肺炎克雷伯菌特異性基因，擴增結果顯示出現1條約430 bp特異性條帶，與目標條帶片段大小一致，鑒定結果見圖5，確定為肺炎克雷伯菌。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.樣品編號

2.6 K血清型PCR檢測通過PCR方法對主要流行的肺炎克雷伯菌血清型K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57進行檢測，獲得血清型特異性基因大小為741 bp(圖6)，與肺炎克雷伯菌血清型K20特異性基因的大小一致，說明本次分離所得的西藏牦牛源8株克雷伯菌均為K20型。

M.DL2000 DNA Marker；K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57.血清型編號

2.7 毒力基因檢測采用PCR方法對肺炎克雷伯菌 3種毒力基因mrkD、fimH和wabG進行檢測，結果顯示3種毒力基因在8株西藏牦牛源肺炎克雷伯菌分離菌株中檢出率為100%(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker；1.mrkD基因；2.fimH基因；3.wabG基因

2.8 耐藥基因檢測采用PCR技術對8株牦牛源肺炎克雷伯菌臨床分離菌株進行6類12種耐藥基因的檢測(圖8)。結果顯示，林芝市分離的6株菌株對4類藥物產生耐藥，分別為四環素類、大環內酯類、碳青霉素類和磺胺類，耐藥基因分別為tetA、blaTEM、blashva-1和sul3。那曲市分離的2株菌株對2類藥物產生耐藥，分別為碳青霉素類和磺胺類，耐藥基因分別為blaTEM和sul3。其中，blaTEM和sul3兩種耐藥基因檢出率100%，其余耐藥基因均未檢出。

2.9 藥敏試驗

2.9.1西藏牦牛源克雷伯菌耐藥情況 西藏林芝市和那曲市的8株牦牛源克雷伯菌對13種常用抗菌藥物有不同程度的耐藥性，結果詳見表4和圖9。

2.9.28株耐藥菌株的耐藥譜 8株西藏牦牛源耐藥克雷伯菌對13種抗菌藥物有不同程度的耐藥性，且出現多重耐藥現象，最多為9種，最少為2種。9耐菌株所占總菌株比例最大為37.5%，其次是2耐為25%，8耐、7耐和6耐均為12.5%。

M.DL2000 DNA Marker；1～12.耐藥基因(yrB、gvrA、sul3、sul2、sul1、aadA1、BlaROB-1、blaSHV-1、blaTEM、ermF、tetA、tetD)

表4 8株牦牛源肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結果(抑菌圈直徑) mm

圖9 西藏牦牛克雷伯菌對13種抗菌藥的耐藥率

3 討論

自肺炎克雷伯菌首次從患有大葉性肺炎病人的肺臟組織中分離培養后，國內外學者相繼從牛、羊、雞、兔、豬等多種畜禽體內分離出肺炎克雷伯菌并對其進行相關研究[28]。近年來，由于抗生素的廣泛使用導致克雷伯菌耐藥現象越來越嚴重，嚴重影響畜禽，尤其是毛皮動物等養殖業發展。

本研究從西藏那曲市、拉薩市和林芝市牦牛養殖戶患有呼吸道癥狀的牦牛病料中進行病原菌的分離，對所分離的菌株進行生化特性、16S rDNA及特異性基因鑒定，并對16S rDNA基因進行序列分析，同時對分離菌株進行莢膜血清分型、毒力基因、耐藥基因和耐藥性分析研究。結果從所采集的103份鼻拭子中成功分離出8株克雷伯菌，其中林芝市分離率最高達13.9%，其次是那曲市為6.67%，拉薩市未分離到。分離的8株菌株均發酵各種糖類，不產生H2S，與牛源肺炎克雷伯菌生化特性基本一致。此外，分離菌經PCR擴增出430 bp的特異性基因(Khe)，進一步驗證了分離菌為肺炎克雷伯菌。16S rDNA序列進化分析顯示，西藏牦牛源分離菌株與肺炎克雷伯菌同源性達97%，其中與KM096433和JQ003560聚為一簇，其親緣關系最近。

肺炎克雷伯菌的菌體表面有大量的莢膜多糖，能夠使菌體抵抗宿主細胞的吞噬能力[29]。根據莢膜多糖(K)分型，目前主要有K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57等。據報道[30]，K1和K2型為毒力最強的血清型。本次從西藏牦牛呼吸道病料中分離的8株菌株均為K20血清型。

有文獻報道[31]，肺炎克雷伯菌多種毒力基因中mrkD、fimH和wabG非常保守且具有高度同源性，說明這3種毒力基因是重要的致病因子。本試驗對所分離的8株菌株進行mrkD、fimH和wabG這3種重要毒力基因檢測，發現8株菌株均可檢測到3種毒力基因，說明流行在西藏牦牛群中的肺炎克雷伯菌對牦牛具有一定的致病性，需要引起注意。

此外肺炎克雷伯菌對多種常用抗菌藥物表現多重耐藥[32]。本試驗對分離的8株菌株進行大環內酯類、磺胺類、四環素類、鏈霉素類、喹諾酮類、碳青霉烯類等6類耐藥基因進行檢測，結果顯示林芝市檢出4類耐藥基因，分別為四環素類、大環內酯類、碳青霉素類和磺胺類，耐藥基因分別為tetA、blaTEM、blashva-1和sul3。那曲市檢出2類耐藥基因，分別為碳青霉素類和磺胺類，耐藥基因分別為blaTEM和sul3，其余的耐藥基因均未檢出。13種常用抗菌藥物耐藥表型檢測結果顯示，西藏牦牛源肺炎克雷伯菌具有較高的耐藥性，對青霉素和氨芐西林耐藥率達100%，其次是克拉霉素、四環素和多西環素耐藥率達75%，與檢出的耐藥基因結果基本一致。而分離菌株對喹諾酮類藥物，如：環丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星強敏感，這與喹諾酮類耐藥基因檢測結果也完全一致。在這些耐藥菌株中，多重耐藥現象也較嚴重，耐藥譜集中在 2～9 耐，其中 9耐居多，其次是2耐和7 耐菌株，分別占總菌株的37.5%，25.0%，12.5%。 隋明等[23]對四川地區牦牛克雷伯菌的耐藥情況進行檢測，結果顯示對氨芐西林、阿莫西林、多西環素等藥物耐藥率較高；最高達90.70%，且耐9，10種藥物的菌株居多。此外，耐藥基因檢測結果中blashva-1、blaSHV、sul2、sul3和floR5基因的檢出率較高，這與本次耐藥及耐藥基因檢測結果基本一致，說明高原地區牦牛克雷伯菌耐藥現象呈相同趨勢，且說明單一菌株攜帶多種抗生素耐藥基因的情況越來越常見。韓坤等[33]對山東省貂源肺炎克雷伯菌進行耐藥性分析發現，分離菌對喹諾酮類耐藥性較高；此研究結果與本試驗結果存在一定的差異，這可能與感染的宿主不同所致。

綜上所述，肺炎克雷伯菌在西藏牦牛中存在一定的流行趨勢，且其耐藥率及多重耐藥現象越來越嚴重，說明今后在用藥時務必要根據藥敏試驗結果，有針對性地使用，還應考慮采取聯合用藥、交叉或輪換用藥等方法，杜絕濫用抗菌藥物，相關部門也需要加強管理，控制疫情的流行與暴發。