羊源肺炎克雷伯菌的分離鑒定及毒力基因檢測

范培超，史量全，溫樹波，霍曉偉，薛江東，馬德慧

(內蒙古民族大學 動物科學技術學院，內蒙古 通遼 028000)

克雷伯菌屬腸桿菌科，有肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、植生克雷伯菌和土生克雷伯菌4 個種[1]。其中，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)廣泛分布于動物的消化道以及水、土中[2]，作為一種人畜共患菌與條件致病菌，該菌在醫院臨床感染上的報道十分常見，癥狀表現為肺炎、腹膜炎、子宮炎以及腹瀉，甚至發生敗血癥[2]。畜禽以及野生動物亦有相當數量的感染情況。近年來，高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HVKP)的出現及流行，且其多樣的莢膜血清型(常見如K1、K2、K5、K20、K54、K57)成為了研究熱點。高毒力與耐藥性曾被認為不重疊出現[3]，但在亞洲的一些HVKP流行國家，關于耐抗菌藥物的HVKP分離株報道越來越多，尤其是HVKP獲得性碳青霉烯耐藥情況的出現，正在對HVKP的臨床用藥造成威脅。SHON等[4]預測HVKP超毒力和廣泛耐藥可能會趨同，使藥物治療變得越來越困難，如果不加以干預，HVKP將會變為繼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等后的“超級細菌”。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器MH肉湯培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物制品有限公司；革蘭染色液購自北京奧博星生物技術有限責任公司；DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、PCR Mastermix、6×DNA Loadding Buffer購自日本TaKaRa公司；VeritiTMDx 梯度PCR儀購自賽默飛世爾科技有限公司；SPF級昆明小鼠購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 病死羊剖檢內蒙古通遼市開魯縣一羊場病死送檢羊，剖檢3只，并觀察臟器病理變化。

1.3 細菌的分離與培養無菌取病死羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟涂片，并接種于血瓊脂平板，37℃培養18 h后可見肺臟組織接種的區域長出多個單菌落，挑取單菌落革蘭染色后鏡檢，并對單菌落進行分離、MH肉湯固體平板培養基純化。

1.4 分離菌株生化及藥物敏感性試驗使用BD PhoenixTM100全自動微生物分析系統對菌株進行生化特性鑒定。用無菌棉簽從純培養18 h的MH肉湯固體平板培養基上挑取單個菌落，在鑒定肉湯管中制成0.6麥氏比的菌懸液，將制備好的肉湯倒入革蘭陽性鑒定藥敏復合檢測板，再將檢測板放入儀器中，反應結束后儀器自動讀卡并顯示結果，重復3次。吸取50 μL 1×107CFU/mL菌液，均勻涂布于MH肉湯固體平板培養基平板上，間隔放置抗菌藥物藥敏紙片，37℃培養12 h后觀察結果，重復3次。

1.5 分離菌株小鼠致病性試驗將小鼠分為試驗組和對照組，其中試驗組分為2個小組，每組5只鼠，試驗組2個小組的小鼠分別腹腔注射106,108CFU/mL 分離菌液，0.5 mL/只；對照組的5只小鼠分別腹腔注射0.5 mL生理鹽水，注射后每2 h觀察并記錄小鼠臨床狀態。無菌將死亡小鼠的肺臟、肝臟橫截面涂片，接種于血瓊脂平板，37℃培養18 h，挑取單個菌落，再次進行16S rDNA PCR 擴增測序鑒定。

1.6 分離菌株的16S rDNA PCR鑒定按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌DNA。PCR擴增引物使用16S rDNA擴增通用引物，由上海生物工程有限公司合成。其中上游引物27f序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492r序列為5′-ACGGCTACCTTGTTACGA-CTT-3′。PCR擴增反應的總體系為25 μL：PCR Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物各1 μL。反應條件：95℃ 4 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃ 10 min。PCR產物部分經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分進行16S rDNA測序和BLAST分析。

1.7 分離菌株部分毒力基因PCR檢測通過魏丹丹等[5]和曹敬榮等[6]研究可知，不同莢膜血清型的肺炎克雷伯菌所含毒力基因存在重復。根據文獻[7-8]合成引物(表1)，引物由上海生工生物公司合成。

2 結果

2.1 病死羊剖檢結果可見氣管、支氣管內及咽口部有泡沫樣液體(圖1)，肺臟充血且伴有氣腫樣病變(圖2)，十二指腸黏膜有點狀出血。

2.2 分離菌株分離培養結果病死羊臟器組織劃線平板培養16 h后，僅肺臟組織劃線的平板上有菌落生長，且菌落不溶血。挑取單個菌落接種于LB液體培養基中，200 r/min，37℃振蕩培養16 h。吸取菌液 5 μL于無菌載玻片上，革蘭染色，鏡檢為紅色陰性菌，兩端較鈍，呈單一或成對的粗短球桿狀(圖3)。分離菌在中國藍瓊脂上的菌落呈藍紫色(圖4)，在血瓊脂平板上呈乳白色，未發現溶血現象(圖5)，在麥康凱瓊脂平板上呈粉紅色(圖6)。將分離菌命名為“TLKL1”。

表1 毒力基因引物信息

圖1 病死羊剖檢咽口部有泡沫樣液體

圖2 病死羊剖檢肺部充血及氣腫樣病變

圖3 分離菌革蘭染色形態(×1 000)

圖4 分離菌在中國藍瓊脂上菌落形態

2.3 分離菌株生化及藥物敏感性試驗結果BD PhoenixTM100全自動微生物分析系統生化特性鑒定結果顯示，該菌可以分解D-果糖、右旋糖、蔗糖、麥芽糖等，可產檸檬酸，不產尿酸、多黏菌素B、黏桿菌素等(表2)，符合肺炎克雷伯菌的生化特性。

藥敏試驗以抗菌藥物的抑菌環直徑大小作為判定依據，結果表明分離株對諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、多西環素等藥物高度敏感；對復方新諾明、卡那霉素等中度敏感；對慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢氨芐等耐藥(表3)。

圖5 分離菌在血平板上菌落形態

圖6 分離菌在麥康凱平板上菌落形態

表2 分離菌生化試驗結果

2.4 分離菌株對小鼠致病性試驗結果對照組小鼠在試驗期內精神狀態良好。試驗組中，注射0.5×106CFU組的小鼠6 h后出現食欲廢絕、精神萎靡的現象，12 h時死亡3只。注射0.5×108CFU組的小鼠12 h全部死亡。剖檢死亡小鼠，對肺臟及肝臟涂片鏡檢，均觀察到短粗革蘭陰性桿菌(圖7,8)。小鼠致病性試驗結果表明，本研究中分離到的短粗革蘭陰性桿菌具有較強致死性。

2.5 分離菌株的16S rDNA PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果可見約為1 500 bp的高亮目的條帶(圖9)。將分離菌株與死亡小鼠臟器分離菌的測序序列分別命名為“TLKL1”、“TLKL2”，測序結果在NCBI網站進行BLAST比較分析，結果兩序列均與序列號為KJ803912.1(中國江南株)肺炎克雷伯菌同源性最高，達99.59%。

表3 分離菌株藥敏結果

圖7 死亡鼠肝臟涂片 (1 000×)

圖8 死亡鼠肺臟涂片(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker；1.TLKL1 PCR產物；2.TLKL2 PCR 產物

2.6 分離菌株部分毒力基因PCR檢測結果分離株毒力基因PCR結果顯示，fimH、ureA、Uge、wabG、ybtA有高亮且單一的目的條帶(圖10)。

M.DL2000 DNA Marker；1.rmpA；2.wcaG ；3.fimH；4.ureA；5.Uge；6.wabG；7.ybtA

3 討論

2016年11月發布的全國細菌耐藥性檢測報告顯示，革蘭陰性菌中，肺炎克雷伯菌的臨床檢出率僅次于大腸埃希氏菌，排名第二[9]，并且呈逐年增高趨勢。該菌可引起人的多種并發癥，例如化膿性肝膿腫、腦膜炎、眼內炎和重癥肺炎。畜禽肺炎克雷伯菌致病多為散發，常引起肺泡壁和肺組織壞死，臨床特點為突然起病，有高熱、咳嗽，并伴有消化道癥狀。該菌可利用多種毒力因子，特別是膠囊多糖、脂多糖、菌毛、外膜蛋白等因子，用于感染期間的存活和免疫逃避[10]。本研究中所采用的BD PhoenixTM100全自動微生物分析系統和16S rDNA檢測法較傳統細菌鑒別方法更加專業和快捷,其中16S rDNA具有高度的保守性和特異性,普遍應用于細菌鑒定，是細菌種屬鑒定的分子生物學基礎[11]。藥物敏感性試驗結果顯示，對多種抗菌藥物敏感或高度敏感，對少部分頭孢類藥物耐藥，這可能與該羊場長期或多次使用該類藥物有關。

該分離菌株在小鼠致病性試驗中所顯示出的強致死力使得對其進行毒力基因檢測顯得尤為必要，且毒力基因檢測結果顯示，5種毒力基因fimH、ureA、Uge、wabG、ybtA均呈陽性，且不排除還有其他毒力基因的可能。肺炎克雷伯菌主要有Ⅰ 型菌毛、Ⅲ型菌毛。其中Ⅰ型菌毛是甘露糖敏感型，由fim(B、E、A、I、C、D、F、G、H)的基因群表達，菌毛的尖端黏附素 fimH 與宿主糖蛋白中的含甘露糖的三糖結合，來介導細菌黏附并侵入宿主的細胞[12]；ureA為尿素酶基因座[13]，尿素酶在水解尿素時對組織有損傷作用。REGUE等[14]和MIETHKE等[15]證明,在小鼠試驗中，uge基因的突變株不能引起尿路感染，而且在其他兩個動物模型( 敗血病和肺炎)中呈現完全無毒的現象，然而將uge野生型基因再次引入相應突變株中，野生菌的表型則完全恢復，感染小鼠后，小鼠患有尿路感染、敗血病和肺炎等。wabG毒力基因的作用是使菌體分泌細胞黏附式莢膜多糖，KARAMA等[16]發現，該基因的突變會使外核心脂多糖(包括O抗原)的合成受阻。

本試驗結果與魏丹丹等[5]、曹敬榮等[6]及李花等[17]研究中所得到的rmpA和aerobactin2種毒力基因在該菌中的高檢出率有所不同，因此猜測，人源肺炎克雷伯菌與動物源毒力基因攜帶情況存在較大差異。目前，肺炎克雷伯菌的分型及相關毒力基因的所屬關系，以及毒力基因的表達能力尚不明確。且高毒力肺炎克雷伯菌的出現給臨床用藥帶來巨大壓力。根據菌株可能攜帶的毒力基因對其可能導致的疾病做出推測，以及如何快速有效緩解該菌在臨床上的感染情況是急需要解決的問題。