2016-2019年我國部分地區(qū)雞滑液囊支原體分離株vlhA基因遺傳進化分析

謝 迪，馬 爽，楚電峰，孫通行，陳夢瑤，何吉鑫， 吳艷濤，杜元釗，范根成，張小榮,*

(1.揚州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；2.青島易邦生物工程有限公司 動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東 青島 266114)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)是感染雞和火雞的重要病原體之一，可引起急性或慢性傳染性滑膜炎或氣囊炎，導(dǎo)致病死率和用藥成本增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。MS可以通過直接接觸橫向傳播，也可以通過種蛋垂直傳播[2]。MS感染在我國雞群中廣泛流行，尤其是在近5年間，MS的嚴重感染對我國的養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。MS目前只有1種血清型，但通過對不同毒株基因序列的差異分析可以分為不同的基因型，雖然基因型與毒株的抗原性和致病性無顯著相關(guān)性，但可以用于進行流行株的溯源分析。目前已報道的區(qū)分MS基因型的方法有多種，其中BENCINA等[4]和JEFFERY等[5]建立的根據(jù)可變脂蛋白血凝素A(vlhA)基因5′端片段的序列進行基因型劃分的方法應(yīng)用最為普遍。本研究從江蘇、安徽、山東、河南、河北、寧夏、黑龍江、湖北等8個省份的臨床發(fā)病雞群中進行MS的分離鑒定，通過vlhA基因測序分析來確定我國流行的MS優(yōu)勢基因型，同時也為研制適合我國的MS疫苗提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源樣品采集自江蘇、安徽、山東、河南、河北、寧夏、黑龍江、湖北等8個省份疑似發(fā)生MS感染的雞場，共78個雞群255只病雞的樣品。

1.2 主要試劑支原體培養(yǎng)基購自O(shè)XOID公司；精氨酸和半胱氨酸購自Sigma-aldrich公司；β-NAD和葡萄糖購自上海生工生物工程有限公司；細菌基因組DNA試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；AceQ?qPCR Probe Master Mix購自諾維贊公司；TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity(5 U/μL)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的分離、純化及鑒定用棉拭子無菌擦取病雞上顎裂隙的黏液及關(guān)節(jié)液，放入含有1 mL已加熱至37℃的支原體液體培養(yǎng)基的2 mL離心管中，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h后，用0.45 μm濾器過濾置于12 mL一次性試管中，加入1倍體積的無菌支原體培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基顏色改變。

取200 μL菌液于支原體固體培養(yǎng)基上37℃涂布培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落生長情況；用滅菌小刀切取含有單個煎蛋樣典型菌落的瓊脂塊，移入支原體液體培養(yǎng)基中壓碎進行培養(yǎng)，至培養(yǎng)基顏色改變后，用支原體液體培養(yǎng)基按照1∶10 000稀釋培養(yǎng)物，再取200 μL稀釋后的培養(yǎng)物于支原體固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)，如此反復(fù)2～3次，獲取純化的支原體[6-7]。通過MS特異性qPCR進行分離株的鑒定[8]，來自同一雞群病雞的分離株不重復(fù)統(tǒng)計。

1.4 分離株基因分型根據(jù)文獻[5]報道的方法克隆分離株vlhA基因5′端保守區(qū)序列，構(gòu)建遺傳進化樹，確定基因型。

1.4.1DNA模板的制備 將-70℃凍存的MS菌株放入37℃水浴鍋迅速融化，接種至裝有5 mL支原體培養(yǎng)基的一次性試管，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)12～24 h；取培養(yǎng)液100 μL至1.5 mL離心管中，加入1 mL PBS，12 000 r/min離心10 min；棄掉1 000 μL上清液，收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑說明書進行MS基因組的提取，提取后的模板置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2引物合成 參照文獻[5]所設(shè)計的MSvlhA基因分型引物MS Link-F： 5′-TACTATTAGCAGCTAGTGC-3′；MS Cons-R： 5′- AGTAACCGATCCGCTTAAT-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4.3vlhA基因的PCR擴增 PCR反應(yīng)體系參照TransTaq?HiFi DNA Polymerase的說明書進行操作。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如與預(yù)期目的條帶大小一致，則進行切膠回收。

1.4.4目的片段序列的測定及分析 將回收純化的PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，結(jié)果使用Lasergene 7.1進行編輯處理，用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap值設(shè)定為1 000，觀察遺傳進化關(guān)系。構(gòu)建遺傳進化樹時使用的MS參考菌株[9-13]信息見表1。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離鑒定根據(jù)在支原體固體培養(yǎng)基平板上形成的特征性煎蛋樣菌落特征和qPCR鑒定結(jié)果，顯示共分離到48株MS分離株，菌株信息見表2。

2.2 MS分離株vlhA基因的遺傳進化分析及分型結(jié)果48株MS分離株vlhA基因PCR擴增產(chǎn)物大小均為約400 bp，經(jīng)基因測序確認均為特異性擴增。所有分離株vlhA基因核苷酸序列均上傳至GenBank,所獲得序列登錄號見表2。通過將分離株vlhA基因序列與24個參考菌株的基因序列一起構(gòu)建遺傳進化樹(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中46個分離株屬于K基因型，只有分離株Shandong/2019-1屬于A基因型和Henan/2019-1屬于E基因型(表2)。

表1 參考菌株信息

表2 48株MS分離株背景信息及分型結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

MS感染在大部分情況下均不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此長期以來在我國并未得到足夠的重視。在2010年之前，國內(nèi)關(guān)于MS感染的流行病學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)幾乎就是空白。直到近年來才開始有一些學(xué)者對國內(nèi)雞群MS感染的狀況做了較為系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，如SUN等[3]對2010―2015年來源于國內(nèi)16個省份的雞血清進行檢測,抗體陽性率高達63.2%；而XUE等[14]用ELISA方法對2010―2015年來自中國21個省的44 395只未接種疫苗雞的滑液囊支原體血清陽性率進行了估算，總血清陽性率為41.19%。這些監(jiān)測數(shù)據(jù)均表明MS感染在我國還是非常普遍的，但是長期以來，由MS感染所導(dǎo)致的傳染性滑膜炎等典型病例僅僅呈現(xiàn)為零星發(fā)生，并未造成嚴重的經(jīng)濟損失。自2017年以來，我國主要養(yǎng)雞地區(qū)幾乎在同一時間開始出現(xiàn)了越來越嚴重的MS感染暴發(fā)，中國地方雞種、白羽肉雞、蛋雞甚至很多種雞群均也波及，典型的臨床病例頻繁出現(xiàn)，部分雞群發(fā)病率甚至可高達30%以上，同群未發(fā)病的雞整體生產(chǎn)性能也受到很大的影響。關(guān)于暴發(fā)的原因，業(yè)界存在不同的分析，有的專家認為跟從國外引進種雞有關(guān)，尤其是近幾年受海外禽流感疫情的影響導(dǎo)致的封關(guān)政策而頻繁變換引種來源可能是重要的原因。也有專家認為跟我國最近幾年養(yǎng)雞行業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致養(yǎng)殖規(guī)模擴張?zhí)煊嘘P(guān)。針對這種現(xiàn)狀，引入分子分型的方法對流行菌株進行溯源分析，將有助于闡明MS在我國的傳播和流行的真實狀況。

根據(jù)對不同來源MS的vlhA基因5′末端序列進行分析，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在16種不同的基因型(A～K)[4-5,15-18]，其中A～J基因型均由國外研究發(fā)現(xiàn)，K基因型為在我國首先發(fā)現(xiàn)。根據(jù)SUN等[13]對2013―2014年從中國16個省份分離出110株MS菌株的分型結(jié)果，所有新分離株均屬于一種獨立的新基因型即K亞型。而本研究對近3年從國內(nèi)8個省份分離鑒定的48株MS分離株進行分子分型的結(jié)果同樣也顯示，其中有46株均屬于K基因型，這說明我國流行的MS優(yōu)勢基因型仍為獨有的K基因型，并未發(fā)生明顯的變化。該研究結(jié)果也提示我們，我國近年來發(fā)生的MS暴發(fā)并非由于引種等因素而造成的輸入型感染，其傳染來源仍在國內(nèi)，需要從傳播途徑、飼養(yǎng)模式、藥物使用等多個不同角度進一步深入研究控制MS感染的有效措施。