西藏那曲牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及生物學(xué)特性

羅潤(rùn)波，貢 嘎，高家登，扎西次仁，白瑪桑珠，索朗斯珠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣總站，西藏 那曲 852000；3.西藏那曲市班戈縣農(nóng)牧科學(xué)技術(shù)服務(wù)站，西藏 班戈 852500)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱為魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，是一類革蘭陽(yáng)性桿菌，芽孢桿菌屬。產(chǎn)氣莢膜梭菌在臨床上屬于條件性致病菌，在自然界和動(dòng)物的胃腸道中均有廣泛分布[1]，最初在野生動(dòng)物，包括野豬和山羊等體內(nèi)分離鑒定到魏氏梭菌，隨后逐漸傳播到家畜當(dāng)中，為世界各地的畜牧業(yè)帶來(lái)了困擾。當(dāng)動(dòng)物腸道內(nèi)菌群失調(diào)或紊亂時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)在體內(nèi)迅速且大量增殖，并分泌外毒素導(dǎo)致宿主腸道疾病的發(fā)生，并伴隨著毒血癥或是猝死。根據(jù)分泌的4種毒素：α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)、ι(ITTXA和ITTXB)的不同，產(chǎn)氣莢膜梭菌可被分為A、B、C、D、E 共5個(gè)毒素亞型[6]。

牦牛猝死綜合征在臨床上主要是由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起，對(duì)我國(guó)牦牛飼養(yǎng)業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病的牦牛會(huì)表現(xiàn)為急性出血性腸炎，實(shí)質(zhì)性器官的出血，腹部腫脹，皺胃鼓氣，并最終導(dǎo)致患畜突然死亡[7]。由于該病發(fā)病急，病程短，且引起該病的病原特征和發(fā)病機(jī)制并不清楚，因此值得進(jìn)一步研究和深入探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料2018年5―7月份西藏那曲市多地牦牛發(fā)生猝死現(xiàn)象，死亡牦牛出現(xiàn)牛舌脫出口外，肛門(mén)外翻，腹部膨脹；剖檢結(jié)果顯示腸黏膜嚴(yán)重出血，各實(shí)質(zhì)性器官有出血點(diǎn)和出血斑，肉質(zhì)無(wú)明顯異常(圖1)。無(wú)菌采集猝死和發(fā)病牦牛的病料，包括肝臟、肺臟、心臟、腎臟、腸內(nèi)容物和糞便。

1.2 主要儀器及耗材離心機(jī)、移液器由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均由美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn)；厭氧罐由三菱化工提供。各類培養(yǎng)基及生化試劑均購(gòu)自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成及測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司完成；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、核酸染料、克隆載體pMD18-T購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α由TaKaRa公司制做并保存；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)；革蘭染色液、瓊脂糖由北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)；厭氧產(chǎn)氣袋由日本三菱生產(chǎn)；藥敏片由杭州微生物試劑公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)菌的分離病料送往實(shí)驗(yàn)室以后，進(jìn)行觸片，革蘭染色鏡檢。同時(shí)，將病料接種于厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h后，選取產(chǎn)氣組，用接種環(huán)蘸取少量菌液涂布于綿羊血瓊脂平板，隨后置于厭氧罐，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h。平板上形成有明顯溶血環(huán)的單菌落挑入梭菌增菌培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h，獲得分離菌株，并進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

1.4 生化試驗(yàn)生化試驗(yàn)參考伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第8版，表15.12)。將增菌后的菌液接種于不同的生化鑒定管中，生化試劑均購(gòu)于青島海博生物，包括酪蛋白(HB0252)、卵磷脂酶(HB0262)、吲哚(GS001)、脂酶(GB096)、葡萄糖(SN016)、甘露糖(GB069)、麥芽糖(SN017)、乳糖(GB004)和水楊苷(GB174)。

1.5 分離菌株的PCR鑒定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行分離菌株的基因組提取。采用16S rRNA擴(kuò)增引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′),1387R(5′-GGGCGGWGTGTACA-AGGC-3′)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增[8]。擴(kuò)增體系:上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL， 10× TransTaq-T Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq-T DNA Polymerase 1 μL，模板2 μL，ddH2O 36 μL，總體系為50 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min (30個(gè)循環(huán))；最后72℃ 延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，并連入pMD18-T載體，最后轉(zhuǎn)入Trans 5α中，挑取陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行增殖并送測(cè)序。

1.6 多重PCR分型鑒定對(duì)分離菌株進(jìn)行多重PCR毒素分型鑒定，產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素分型引物見(jiàn)表1[4]，基因組的提取同上。多重PCR擴(kuò)增體系如下：上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL(共4對(duì)引物,見(jiàn)表1)，10× TransTaq-T Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq-T DNA Polymerase 1 μL，模板 2 μL，ddH2O 30 μL，總體系50 μL。PCR反應(yīng)程序如下:94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s (30個(gè)循環(huán))；最后72℃ 延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR毒素分型鑒定引物信息

1.7 分離菌的動(dòng)物致病性試驗(yàn)和外毒素毒力試驗(yàn)將分離株接種到綿羊血平板中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h 后挑取具有典型溶血環(huán)的單菌落，轉(zhuǎn)接至厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)14～16 h。按照5%的比例繼續(xù)轉(zhuǎn)接到厭氧肉肝湯培養(yǎng)基43℃厭氧振蕩培養(yǎng)6 h，12 000 r/min 離心15 min 取上清，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，獲得分離株外毒素。取上一步厭氧肉肝湯培養(yǎng)基的菌體，稀釋到108CFU/mL，作為動(dòng)物試驗(yàn)菌體。

制備的外毒素按照2倍倍比稀釋，5只BALB/c小鼠為一組，每只腹腔注射0.2 mL。對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水，連續(xù)觀察72 h，記錄小鼠死亡情況。制備的菌體不稀釋，5只BALB/c小鼠為一組，每只腹腔注射1 mL。對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水，連續(xù)觀察72 h同時(shí)記錄小鼠死亡情況。同時(shí)取菌體攻毒試驗(yàn)組小鼠的病變臟器進(jìn)行觸片染色鏡檢并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

調(diào)查問(wèn)卷分為《校企合作問(wèn)卷調(diào)查表（學(xué)生用卷）》和《校企合作問(wèn)卷調(diào)查表（企業(yè)用卷）》兩種。其中學(xué)生用卷主要調(diào)查內(nèi)容為：15道客觀選擇題和1道主觀題（作為大學(xué)生，您希望在校開(kāi)展哪些與專業(yè)相關(guān)的英語(yǔ)課程？） 通過(guò)學(xué)生用卷，主要了解到大學(xué)生更傾向于哪種大學(xué)英語(yǔ)教學(xué)模式、對(duì)于增設(shè)專業(yè)英語(yǔ)課程的看法、校企合作對(duì)于英語(yǔ)學(xué)習(xí)的啟示以及校企合作下是否有助于大學(xué)英語(yǔ)教學(xué)改革等方面。企業(yè)問(wèn)卷主要調(diào)查內(nèi)容為：12道客觀選擇題和1道主觀題（貴企業(yè)希望大學(xué)生加強(qiáng)哪些英語(yǔ)能力的培養(yǎng)？）通過(guò)企業(yè)用卷，調(diào)查企業(yè)期待的畢業(yè)生應(yīng)具備哪些英語(yǔ)能力、英語(yǔ)在企業(yè)中的重要性和校企合作下的大學(xué)英語(yǔ)教學(xué)存在的主要問(wèn)題等方面。

1.8 16S rRNA進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)3株分離株16S rRNA序列的63～1 387堿基序列進(jìn)行BLAST比對(duì) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。將代表序列和分離株序列用MEGA 6.0 Clustal W算法進(jìn)行比對(duì)分析，并參考鄰接法繪制進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap 1 000)。

1.9 藥敏試驗(yàn)將3株分離株接種到厭氧肉肝湯培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)至D600達(dá)到0.6～0.8，取300 μL 菌液涂布梭菌增菌培養(yǎng)基平板，并貼上對(duì)應(yīng)的藥敏片，在37℃厭氧培養(yǎng)24 h后測(cè)量其抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定結(jié)果顯示，所采集的樣品中均成功分離出疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株。分離菌株均為革蘭陽(yáng)性桿菌(圖2)。在血平皿上形成典型的溶血環(huán)(圖3)，在厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體，在石蕊牛奶培養(yǎng)基中“爆裂發(fā)酵”(圖4)。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：分離株對(duì)酪蛋白、吲哚、脂酶和水楊苷反應(yīng)均為陰性，對(duì)卵磷脂酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖和乳糖反應(yīng)為陽(yáng)性(表2)。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的結(jié)果作為參考，初步確定分離菌株為產(chǎn)氣莢膜梭菌。同時(shí)在每頭牦牛樣品的分離菌株中挑選1株，共計(jì)3株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增(圖5)。經(jīng)過(guò)NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3株分離菌均為產(chǎn)氣莢膜梭菌。同時(shí)將基因序列上傳GenBank(登錄號(hào)為：MN960261、MN960262和MN960263)。

圖2 細(xì)菌革蘭染色鏡檢

圖3 血平皿上菌落形態(tài)

圖4 石蕊牛奶和厭氧肉肝湯生長(zhǎng)情況

表2 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素分型對(duì)3株分離菌進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增、鑒定，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，2株分離菌AD-01和AD-02只擴(kuò)增出α毒素基因，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌；BG-01分離株擴(kuò)增出α和β毒素基因，為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌動(dòng)物致病性和外毒素毒力試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠24 h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組72 h內(nèi)精神狀態(tài)良好，未見(jiàn)死亡。病死小鼠腹部略顯膨大，對(duì)其尸體進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)機(jī)體出現(xiàn)全身性病理變化，消化道以及實(shí)質(zhì)性器官均存在程度不同的出血和病變。大腦出現(xiàn)淤血、腦積液增多；腹腔和胸腔內(nèi)積存大量暗紅色液體；小腸及胃部明顯擴(kuò)張膨脹，呈暗紅色，少量出血，大腸黏膜也略腫脹；肝臟呈暗紅色且明顯腫脹。而對(duì)照組小鼠腹部未見(jiàn)膨脹，且剖檢后腹腔、胸腔未見(jiàn)異常(圖7)。

對(duì)病變臟器進(jìn)行觸片、鏡檢結(jié)果顯示，病變臟器中存在大量革蘭陽(yáng)性桿菌。同時(shí)細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果顯示，試驗(yàn)組均能分離得到該病原菌，生理鹽水對(duì)照組未分離到該細(xì)菌。對(duì)病變肝組織進(jìn)行HE染色顯示，死亡小鼠的肝臟出現(xiàn)充血、細(xì)胞核固縮濃染和細(xì)胞骨架破壞(圖8)。

外毒素感染試驗(yàn)組小鼠精神狀態(tài)不振、食欲不佳、毛皮豎毛、眼睛上瞼下垂、暗沉。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，72 h內(nèi)未見(jiàn)死亡。AD-01、AD-02以及BG-01分離株的死亡情況分別是：未進(jìn)行稀釋組72 h 內(nèi)全部死亡；2-1試驗(yàn)組病死率均為40%；2-2試驗(yàn)組病死率分別是0%，20%，40%；2-3稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組病死率為0%，全部存活。具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。以上動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株及外毒素對(duì)小鼠均有強(qiáng)的致死性，符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病特征。

A.AD-01；B.AD-02；C.BG-01；D.空白對(duì)照

A.肝細(xì)胞核固縮濃染； B.充血； C.肝細(xì)胞骨架破壞

2.4 遺傳進(jìn)化分析將分離株16S rRNA 序列和國(guó)內(nèi)外的經(jīng)典菌株進(jìn)行比較(圖9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離得到的菌株在進(jìn)化樹(shù)上分屬兩個(gè)不同的分支。BG-01分離株同ATCC13124(人源，美國(guó))分離株顯示出較高的同源性，而且和LGM-J13、 J16、J9、J1株具有共同的來(lái)源(豬源，中國(guó))。另外兩株A型分離株，AD-01和AD-02，在產(chǎn)氣莢膜梭菌的進(jìn)化樹(shù)上屬于一個(gè)獨(dú)立的分支。

2.5 藥敏試驗(yàn)分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，氨基糖苷類藥物對(duì)分離菌均無(wú)作用。同時(shí)，分離菌對(duì)復(fù)方新諾明表現(xiàn)為耐藥，對(duì)苯唑西林、頭孢氨芐、多黏菌素B、呋喃唑酮表現(xiàn)出一定的耐藥，對(duì)大多數(shù)常見(jiàn)抗菌藥表現(xiàn)為敏感。

表3 外毒素攻毒后小鼠死亡情況 %

圖9 基于3株分離株(●)16S rRNA序列進(jìn)化樹(shù)分析(MEGA 6.0，鄰接法)

表4 分離株藥敏試驗(yàn)的抑菌環(huán)直徑 mm

3 討論

近年來(lái)在世界范圍內(nèi)都有關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起動(dòng)物疾病導(dǎo)致大量經(jīng)濟(jì)損失的報(bào)道，包括引起新生犢牛腹瀉、犢牛皺胃炎、仔豬副傷寒以及雞壞死性腸炎。也有研究證實(shí)產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠在雞、綿羊、山羊、豬或者是牛種群內(nèi)引發(fā)大流行，因此產(chǎn)氣莢膜梭菌值得我們深入研究和關(guān)注。本研究中，從病料中分離出疑似病原菌并進(jìn)行了生化鑒定和挑取3株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA的擴(kuò)增鑒定，結(jié)果證實(shí)3株分離株均屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌。這3株菌的動(dòng)物致病性試驗(yàn)和外毒素毒力試驗(yàn)證實(shí)，分離株具有強(qiáng)烈的致病性，外毒素致死性強(qiáng)，符合產(chǎn)氣莢膜梭菌通過(guò)分泌外毒素對(duì)宿主致病的特征。

基于產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素多重PCR結(jié)果，可以將3株分離株歸為兩個(gè)亞型，其中AD-01和AD-02分離株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，BG-01分離株為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。可見(jiàn)在西藏那曲市不同地區(qū)的流行毒株存在型的差異。資料顯示，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在我國(guó)是主要流行菌株，常見(jiàn)于自然環(huán)境中和動(dòng)物糞便中。在西藏已有關(guān)于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌導(dǎo)致巖羊突然死亡的大量病例報(bào)道，這些猝死的巖羊主要表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)器官和肺臟的出血以及嚴(yán)重淤血。除此之外，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在新疆地區(qū)的野豬群里也曾暴發(fā)過(guò)疫情。本研究中，在猝死的家畜中分離到了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，這個(gè)結(jié)果暗示產(chǎn)氣莢膜梭菌從最初的野生動(dòng)物中的流行逐漸傳播到家畜當(dāng)中，應(yīng)當(dāng)引起重視。有趣的是，本研究從猝死的牦牛病料中也分離到了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。一般而言，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離多見(jiàn)于患有胃腸炎的豬或者雞體內(nèi)。然而在本研究中，證實(shí)A型和C型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均能夠?qū)е玛笈５拟馈?/p>

進(jìn)一步的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BG-01分離株(C型)在進(jìn)化樹(shù)上同ATCC13124株和LGM株親緣關(guān)系較近。LGM株本是從江蘇南京的豬體內(nèi)分離到的1株產(chǎn)氣莢膜梭菌，BG-01分離株在進(jìn)化樹(shù)上的分布暗示產(chǎn)氣莢膜梭菌在國(guó)內(nèi)開(kāi)始廣泛流行。除此之外，AD-01和AD-02(A型)分離株在進(jìn)化樹(shù)上處于一個(gè)獨(dú)立于國(guó)內(nèi)其他分離株的分支上，這種進(jìn)化的多樣性一方面有可能是細(xì)菌適應(yīng)西藏惡劣環(huán)境變異所導(dǎo)致的，另一方面也有可能是由于宿主的變化所致。基于產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析同產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因型或是致病特征無(wú)顯著性相關(guān)。因此，一方面我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍才能夠分析產(chǎn)氣莢膜梭菌關(guān)鍵毒素基因和遺傳多樣性，另一方面由于西藏地理環(huán)境的特殊性，對(duì)西藏地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病和遺傳進(jìn)化情況值得我們深入調(diào)查。

近年來(lái)，由于臨床對(duì)抗生素的濫用日趨嚴(yán)重，產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥問(wèn)題也變得越來(lái)越嚴(yán)峻。本研究對(duì)3株分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了30種常用抗生素的耐藥分析，結(jié)果顯示，分離株對(duì)氨基糖苷類藥物無(wú)作用，參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)關(guān)于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)梭菌對(duì)氨基糖苷類藥物存在固有耐藥性，因此該類藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)作用。同時(shí)，3株分離株均對(duì)磺胺類藥物復(fù)方新諾明耐藥。有研究報(bào)道埃及分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)多西環(huán)素耐藥[23]。在本研究中，3株分離株對(duì)多西環(huán)素和四環(huán)素都具有較強(qiáng)的敏感性。除此之外，分離株對(duì)苯唑西林、頭孢氨芐、多黏菌素B、呋喃唑酮表現(xiàn)出一定耐藥。我們還發(fā)現(xiàn)AD-01和AD-02分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相近，而B(niǎo)G-01的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與AD-01和AD-02分離株有一定差異。這可能是因?yàn)锳D-01和AD-02分離株對(duì)應(yīng)的地區(qū)有不合理使用抗生素所造成，提醒我們?cè)谂R床上針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌需要進(jìn)行合理用藥。臨床上可以聯(lián)合或者交叉使用敏感藥物進(jìn)行預(yù)防治療以達(dá)到良好的效果。