健康與腹瀉仔豬源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的多位點序列分型

王婧祺，戴益民，王 嬌，韓春生，曾 秀，吳允正，王林康，張錦華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,Cp)既是普遍存在于自然環(huán)境中的細菌，又是人類食物中毒以及動物胃腸道疾病、壞死性腸炎和腸出血癥的主要病原[1-2]。每年因Cp引發(fā)的疾病都會給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟損失[3]。Cp通常根據(jù)其產(chǎn)生的幾種主要毒素(α，β，ε、ι、NetB和CPE毒素)被分為7種類型(A～G型)[4-5]， A型Cp(CpA)是腸道中常見菌群，但在一定條件下也因產(chǎn)生毒素致病，CpA導(dǎo)致的食物中毒也是人類常見的食源性疾病[6]。近年來常有經(jīng)動物消化道感染CpA，誘發(fā)出血性或壞死性腸炎和腸毒血癥的報道[4-13]。

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，各種分子分型技術(shù)被廣泛應(yīng)用于評估細菌種群多樣性和Cp的暴發(fā)性研究[8-9]。許多研究表明，基于序列分析的多位點序列分型技術(shù)(multilocus sequence typing，MLST)有助于了解分離株的種群結(jié)構(gòu)和遺傳進化，實驗室之間無需交換菌株，通過互聯(lián)網(wǎng)就可以實現(xiàn)世界范圍的流行病學(xué)調(diào)查[10-11]。

本研究基于Cp公開可用的8個管家基因，使用MLST方法對24株CpA的 ST型進行分析，該24株CpA來源于江西省4個地區(qū)的健康和腹瀉仔豬腸道。由于Cp為條件致病菌,在健康仔豬腸道同樣存在。比較同一地區(qū)健康與腹瀉來源CpA的等位基因序列的多態(tài)性,探究CpA對仔豬致病性的分子機制；分析不同地區(qū)健康源CpA和腹瀉來源CpA的差異，了解菌株基因序列中的潛在突變和內(nèi)在聯(lián)系，以及環(huán)境因素對CpA致病性的影響，為制定合理的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CpA DNA的制備從實驗室保存的菌株中選取24株CpA，菌株來源參見周姣等[12]方法：使用無菌棉拭子從江西省4個地區(qū)(南昌、吉安、九江和宜春)的養(yǎng)豬場分別收集7日齡內(nèi)新生健康和腹瀉仔豬的糞便樣本(本試驗所指腹瀉仔豬糞便為常規(guī)性糞便不成形或者水樣便)，按區(qū)域進行標記后將收集到的樣品立即送往實驗室進行菌株分離簽定、16S rDNA測序和多重PCR毒素分型。對選取的24株CpA使用磁珠法DNA提取試劑盒(Cat No：DP712，TIANGEN，China)提取DNA，使用NanoDrop 2000(Thermo Electron Corporation，USA)在260和280 nm的波長下測定DNA濃度。

1.2 MLST方案本研究MLST的管家基因方案參照文獻[14]，除7個常見的管家基因外，還包括編碼α毒素的plc基因。表1列出了選用管家基因的序列長度以及相應(yīng)引物和蛋白產(chǎn)物。

1.3 管家基因序列擴增24份DNA樣品由8個管家基因引物進行PCR擴增。25 μL PCR擴增體系包括：2 μL模板DNA，1×含有Mg2+的PCR緩沖液，0.2 mmol/L脫氧鳥苷三磷酸鹽混合物，2.5 U Taq DNA聚合酶和每種引物800 nmol/L，剩余體積由蒸餾水補齊[15]。PCR擴增條件參照NAKANO等[16]的研究，通過水平瓊脂糖凝膠電泳檢驗所有PCR產(chǎn)物。將PCR擴增片段連接T載體后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆后送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

1.4 核苷酸序列登錄號本研究中發(fā)現(xiàn)的每個獨特序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號如下：dutMK626534-MK626541，recAMK729665-MK-729729675，tpiMK729676-MK729682，sodMK729-683-MK729689，ddlAMK729690-MK729699，gmkMK729700-MK729710，glpKMK729711-MK729-715，plcMK729716-MK729726。

表1 管家基因的選擇和引物序列(參考菌株：ATCC 13124)

1.5 等位基因ST型編號和多樣性分析每個管家基因的所有等位基因按測序獲得等位基因編號。產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124(登錄號NC_008261.1)的核苷酸序列從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得并用于后續(xù)的比較分析。修剪每個等位基因的序列長度，其長度范圍從429 bp(ddlA)至574 bp(glpK)。8個管家基因的每個等位基因按一定順序排列形成等位基因譜，并基于獨特的等位基因譜生成ST型給予序列號。多個ST型由BURST方法聚集成不同的克隆復(fù)合物(cloning complex，CC)，克隆復(fù)合物是由存在部分相同編號的等位基因的多個ST組成，并且每個克隆復(fù)合物被任意分配一個數(shù)字編號。使用START 2軟件(https://pubmlst.org/software/analysis/start2/)構(gòu)建ST型系統(tǒng)發(fā)育樹并用統(tǒng)計學(xué)方法分析突變率[17]。根據(jù)2個ST型之間的距離(距離代表遺傳變化的程度)評估各分支的關(guān)系。如果聚集在同一亞組中是同一節(jié)點的分支，距離近，表明遺傳相似度高。其他數(shù)據(jù)分析，包括對健康源和腹瀉源CpA的聚類分析，則使用MAGE 7.0軟件 (http://www.megasoftware.net/)完成。

2 結(jié)果

2.1 CpA菌株的獲得從通過16S rDNA測序和多重PCR分型被鑒定為CpA的菌株中選取24株，包含健康源和腹瀉源各12株，樣品覆蓋江西4個地區(qū)，每個地區(qū)3株。

2.2 基因多樣性分析MLST管家基因的多樣性顯示在表2中。對比MLST方案的多位點連鎖不平衡標準指數(shù)(standardized)和古典指數(shù)(classical)，2種指數(shù)的觀察方差都大于相對應(yīng)的最大方差值(表3)。本試驗MLST方案中管家基因長度在429 bp(ddlA)和574 bp(glpK)之間，plc、recA和gmk這3個管家基因具有更高的突變。無論是否添加α-毒素調(diào)控基因(plc)，整體ST數(shù)量都沒有變化，并且除去plc基因進行聚類分析可觀察到的克隆復(fù)合物聚集沒有明顯變化。

每個管家基因存在數(shù)量不等的等位基因，數(shù)量在4(glpK)到10(plc)之間，等位基因中存在的可變位點的比例為1.8%(tpi)至6.1%(plc)。8個管家基因的等位基因同義突變與非同義突變的比率范圍是dN / dS = 0.057 0(sod)至dN / dS = 0.360 9(recA)，計算比率都小于1。在12株健康源CpA中，單個管家基因的等位基因數(shù)不超過5；但腹瀉源CpA中管家基因存在更多的突變，單個管家基因突變數(shù)更高。腹瀉源CpA的plc管家基因具有更高的多態(tài)性，存在9種等位基因，而健康源CpA中僅存在以plc-ST3為主的4種等位基因。在整體分析中，glpk等位基因數(shù)量最少，Sawyer游程檢驗中MCF的P值為0.517，MUF的P值為0.515，這也與其他管家基因不同。

2.3 健康源與腹瀉源CpA的聚類分析選取的24株CpA產(chǎn)生24個ST型(圖1)2個克隆復(fù)合體，CC1是其中較大的一組，其余的ST型是獨立的。CC1是以ST-1為中心的克隆復(fù)合體，其中聚集了75%的健康源CpA，江西吉安和宜春地區(qū)的部分腹瀉源ST型與南昌、九江地區(qū)健康源ST型的遺傳距離相對接近并聚集在同一亞組。相比之下，CC2是來自2個地區(qū)樣本明確定義的復(fù)合體，含有4種腹瀉源CpA。通過最小生成樹的聚類分析，不同地區(qū)的CpA菌株之間的親緣關(guān)系并沒有表現(xiàn)一個地區(qū)的菌株呈現(xiàn)單獨的聚集。

表2 CpA管家基因的遺傳多樣性

表3 多位點連鎖不平衡檢測

2.4 不同地域的健康源和腹瀉源CpA聚類分析對健康源和腹瀉源CpA分別聚類分析(圖2)，不同地區(qū)的健康源CpA均存在較高的相似性，地域差異對健康源CpA影響較小。除少數(shù)菌株外，腹瀉源CpA中同一區(qū)域菌株的聚集程度明顯，腹瀉源CpA的地理特異性相對較高。江西九江地區(qū)的2個ST(JJST22、JJST23)是同一節(jié)點的2個分支，有高度相關(guān)性，但這2個ST與其他地區(qū)的腹瀉源ST相比，相似性較低，差異顯著。

系統(tǒng)發(fā)育樹參考株為ATCC13124，已在圖上標記;綠色為健康樣本分離株，紅色為腹瀉樣品分離株

圖2 腹瀉源與健康源CpA菌株的聚類分析(MEGA軟件)

以區(qū)域分界對健康源和腹瀉源CpA聚類情況的分析(圖3)，江西南昌和九江地區(qū)的健康源和腹瀉源CpA分別聚類成2個亞組，健康和腹瀉區(qū)分明顯；南昌的腹瀉源CpA是源自同一節(jié)點的分支，有高親緣性如圖3A，但有些地區(qū)呈交叉分布。

A:NC.南昌；B:JJ.九江；C:YC.宜春；D:JA.吉安。健康樣本分離株 ST1-3；腹瀉樣本分離株 ST4-6

3 討論

多位點連鎖不平衡標準指數(shù)(standardized)和古典指數(shù)(classical)表明本試驗的MLST方案存在明顯的連鎖不平衡，說明8個管家基因的等位基因之間是具有一定程度的遺傳突變關(guān)聯(lián)性，MLST分析結(jié)果具有較高的可信度。等位基因的dN/dS值遠小于1，表明這些管家基因不受外部環(huán)境選擇壓力的影響。等位基因的數(shù)量在一定程度上反映了管家基因的多樣性。在腹瀉源CpA中管家基因plc、gmk和recA的等位基因數(shù)量均高于健康組，說明腹瀉源CpA中管家基因的多樣性較高。

所有類型的Cp都能產(chǎn)生α毒素。許多研究已經(jīng)證明了α毒素對Cp病的影響[18]。因此，本試驗在Cp常見的7個管家基因的基礎(chǔ)上，添加plc基因作為管家基因來評估α毒素基因在核苷酸水平上的突變情況。EFFAT等[19]研究發(fā)現(xiàn)在10株不同毒素類型Cp中，α毒素基因平均有 1.3%的核苷酸序列不同，有1.2% 的氨基酸序列不同，但不同菌株產(chǎn)生的α毒素仍具有相同的生物學(xué)功能。本研究結(jié)果表明同一毒素類型的CpA，其α毒素(plc)基因具有較高的突變，突變位點多達33個(33/544,6.1%核苷酸序列不同)。腹瀉源與健康源CpA間存在的等位基因相似，但數(shù)量不同，腹瀉源CpA中plc等位基因數(shù)量明顯高于健康源，呈現(xiàn)較高的多樣性，最大卡方檢驗表明該結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。但無論是否添加α-毒素調(diào)節(jié)基因(plc)作為管家基因，ST型整體數(shù)量都是不變的，聚類情況差異不明顯。

本研究在不同地區(qū)健康和腹瀉仔豬糞便分離到的24株CpA,根據(jù)MLST方案得到24個ST型，呈現(xiàn)較高遺傳多態(tài)性。該24株CpA覆蓋江西省的4個主要行政區(qū)，在地理區(qū)域的選擇上有一定的代表性。24個CpA均來自相同宿主仔豬，確保宿主因素不影響菌株聚類分析。有報道稱同種宿主來源的菌株所在的環(huán)境區(qū)域不同，因每個區(qū)域都有自己獨特的自然選擇突變而呈現(xiàn)多種ST型；當同種宿主來源的Cp承受同一地區(qū)的選擇壓力時，可以發(fā)現(xiàn)相同地區(qū)的菌株也具有不同的ST型[2，20]。ENGSTR?M等[21]在對7個農(nóng)場中不同健康程度的雞群分離到的Cp表型和基因型的研究中，也發(fā)現(xiàn)來自同一地區(qū)、同一宿主不同健康程度樣本分離到的Cp表現(xiàn)出多種ST型。

健康源和腹瀉源CpA遺傳進化樹分析表明：腹瀉源和健康源的CpA分別相對聚集，CC1是以ST-1為中心的克隆復(fù)合體，聚集了75%的健康源CpA，還有部分腹瀉源CpA零星分布于健康源CpA聚集的CC1亞組中，總體來說不同地區(qū)健康源CpA具有一定的親緣關(guān)系。而江西吉安地區(qū)腹瀉源CpA(ST16、ST18)與其他地區(qū)健康源CpA(ST2、ST12)有較高的相似性，該地區(qū)的健康源與腹瀉源CpA呈現(xiàn)交叉分布的特點。

從UPGMA方法構(gòu)建遺傳進化樹分析，腹瀉源CpA的地理特異性相對較高。CC2亞組中同一地區(qū)的腹瀉源CpA聚集程度明顯,如ST13、ST14和ST15，這3株均分離自南昌，因此這些菌株可能具有相同的遺傳背景。南昌的3株CpA和宜春的1株(ST21)源自同一分支，存在明顯的相關(guān)性，可能由于在江西省的地理分布圖中，南昌和宜春是相互接壤的，菌株在基因突變過程中受到橫向水平的影響。同一地區(qū)健康源和腹瀉源菌株的聚類分析，大部分地區(qū)健康源和腹瀉源CpA聚類明顯，江西九江地區(qū)的健康源和腹瀉源CpA呈交叉分布，較近的親緣關(guān)系提示我們該地區(qū)健康源CpA具有潛在致病的可能。

本研究第1次利用MLST技術(shù)分析從江西省4個地區(qū)分離到的健康和腹瀉仔豬源CpA。聚類分析結(jié)果表明CpA具有較高水平的遺傳多態(tài)性，在基因水平上管家基因glpk相對保守，recA和plc基因變異程度較大，增加或者減去plc基因，對整體聚類情況無明顯影響。健康源和腹瀉源CpA成2個亞組聚集，CC1是以ST-1為中心的克隆復(fù)合體，聚集了75%的健康源CpA。此外，腹瀉源CpA有一定的地理親緣性，其可遺傳的突變有一定的規(guī)律和方向性，因此，推測CpA在仔豬腹瀉中的影響在一定程度上與地域環(huán)境相關(guān)。因本試驗樣本相對較少，有待進一步的試驗結(jié)果驗證。