牛星狀病毒EvaGreen實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

師志海，王文佳，張 彬，孟紅麗，王亞州，金 磊，蘭亞莉*，徐照學,3*

(1.河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南牧業經濟學院 動物醫藥學院，河南 鄭州 450046；3.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002)

犢牛腹瀉是臨床上一種常見的綜合征，影響犢牛健康，進而影響優質畜產品生產，給養牛業造成嚴重危害。其病因復雜，其中病毒感染是引起腹瀉的重要原因[1]。據報道，除了牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等常見的可以導致犢牛腹瀉的病毒外，牛星狀病毒(bovine astrovirus，BAstV)和牛諾如病毒(bovine norovirus，BNoV)等新發病毒在犢牛腹瀉病原譜中也越來越備受關注[1]。

星狀病毒(astroviruses，AstVs)是小型無囊膜的RNA病毒，直徑28～30 nm，具有獨特的5個或6個星狀突起。因其宿主不同，AstVs又可分為兩個屬：哺乳動物星狀病毒屬(Mamastrovirus，MAstV)和禽星狀病毒屬(Avastrovirus)，分別感染哺乳動物和禽類[2]。嬰幼兒感染人星狀病毒是導致腹瀉的主要原因之一。BAstV是MAstV屬的一員，于1978年首次在英國暴發急性腸炎的犢牛中被發現。起初，BAstV被認為不能直接引起犢牛腹瀉，但證實其可侵染牛回腸細胞，與BCoV等病毒聯合感染時，BAstV對犢牛腹瀉的致病力大大增加。2013年發現BAstV的某一譜系與牛的神經疾病和腦炎有關[3]，隨后歐洲、北美、南美[4]等地也相繼報道了類似病例，使得人們對BAstV及其分子流行病學和致病性備加關注。此外，BAstV還可能與牛呼吸系統疾病有關[5]，在患有急性呼吸系統疾病的人和動物的呼吸系統樣本中均可檢到AstV[5-6]。鑒于BAstV在牛不同疾病中的諸多角色，應引起人們注意。

目前，對BAstV的檢測手段主要有直接電鏡觀察、原位雜交檢測病毒的RNA[7]、組織切片免疫組織化學檢測病毒的蛋白[8]和常規或巢式RT-PCR技術檢測病毒核酸[9]。由于BAstV尚無成熟的細胞分離培養體系，且原位雜交技術和組織切片技術過程費時費力，對技術設備和人員素質的要求較高。而傳統的RT-PCR方法盡管較為敏感，但易受到試驗環境、技術操作等條件污染。熒光定量PCR方法是國際公認檢測病毒的黃金標準，因其快速、簡便、安全、靈敏度高且可定量等優點，所以更適用于臨床檢測。然而，當前國內還沒有專門針對BAstV的快速檢測方法。鑒于此，本研究基于BAstV基因的保守區域，建立了檢測BAstV的熒光定量PCR方法，以期為BAstV的診斷及分子流行病學調查提供有力手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株及被檢材料BAstV、BNoV、BCoV及BVDV陽性病料均由本實驗室收集并鑒定保存。221份腹瀉犢牛的糞便樣本于2017年9月至2019年5月在河南部分地區的牛場采集，樣本均采于4月齡以下的腹瀉犢牛。

1.2 主要試劑及儀器MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(9766)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)，pMD18-T Vector Cloning Kit(6011)，E.coliJM109 Competent Cells(9052)，2×Premix Taq(R004A)，DL2000 DNA Marker(3427A)，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762)等為TaKaRa公司產品；質粒小提試劑盒Plasmid Mini Kit(D6943)為OMEGA公司產品；2×EvaGreen qPCR SuperMix(AQ142-21)為北京全式金生物技術有限公司產品。

熒光定量PCR儀(SLAN24P)上海宏石醫療科技公司；高速冷凍離心機(5424R)德國Eppendorf公司；常規PCR儀(TP600)日本TaKaRa公司；超微量分光光度計(NanoDrop2000)美國Thermo Forma公司；凝膠成像分析儀(WD-9413B)中國北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成根據GenBank 公布的BAstV 基因序列(登錄號：KJ620980)，針對BAstV ORF1a基因的保守區域，應用Oligo 6.0軟件設計1對特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 BAstV目的片段PCR擴增引物

1.4 核酸提取將糞便樣品用PBS 按1∶10混懸，反復凍融3次后，漩渦振蕩，4℃、8 000 r/ min離心5 min，收獲上清，-80℃保存用于后續試驗。病毒RNA的提取參照核酸提取試劑盒，-80℃保存病毒RNA。cDNA的反轉錄參照逆轉錄試劑盒，-20℃保存。

1.5 重組質粒標準品的制備以BAstV 毒株的cDNA為模板，使用上述引物進行PCR擴增。反應體系為25 μL：包括2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 5 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收純化目的片段，克隆于pMD18-T載體，構建重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a。將重組質粒轉化至JM109感受態細胞中，后涂在含有氨芐青霉素鈉的LB瓊脂平板上，37℃培養，挑取單菌落擴大培養，提取重組質粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果正確的重組質粒作為反應模板及質粒標準品，用超微量分光光度計測定重組質粒的濃度，計算拷貝數(拷貝數=質粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質粒總長度))。

1.6 實時熒光定量PCR熔解曲線以重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a為模板，按照qPCR試劑盒提供的反應體系進行擴增，即SuperMix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增條件：預變性94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。熔解曲線條件：95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 30 s，60℃ 15 s，驗證引物的特異性。

1.7 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.7.1實時熒光定量PCR反應體系及條件的優化 以重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a為模板，按照qPCR試劑盒提供的反應體系，將退火溫度設置為57,58,59,60,61,62℃ 共6個溫度梯度，對退火溫度進行優化。確定退火溫度后將引物濃度設置為100,200,300,400,500 nmol/L，模板用量設置為1,2,3,4,5 μL，分別對引物濃度和模板用量進行優化篩選。循環條件：預變性94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。

1.7.2標準曲線的建立 將重組質粒依次進行10倍倍比稀釋，得到109～101拷貝/μL等9個稀釋度的標準品模板，按照1.7.1優化的反應條件進行擴增，繪制標準曲線。

1.7.3敏感性試驗 將重組質粒進行10倍倍比稀釋后作為模板，同時用等量Nuclease-free Water作陰性對照，根據已建立的熒光定量PCR方法進行擴增，觀察擴增曲線，確定質粒的最低拷貝數。同時對相同模板進行常規PCR擴增，并比較2種檢測方法的敏感性。

1.7.4特異性試驗 以1.1中待檢病原的cDNA為模板，使用本研究建立的熒光定量PCR方法進行擴增，以重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a為陽性對照，設Nuclease-free Water為陰性對照，以驗證所建方法的特異性。

1.7.5重復性試驗 以1.36×106～1.36×103拷貝/μL 4個稀釋度的重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a為模板，分別進行批內和批間試驗。批內試驗：同一次試驗下模板設3個重復；批間試驗：同一試驗條件下3個不同時間段分別進行3次試驗，每次試驗模板設3個重復；計算模板Ct值的標準差(s)和變異系數(CV)，驗證實時熒光定量PCR方法的可靠性和重復性。

1.8 臨床樣本檢測使用本試驗建立的EvaGreen 熒光定量PCR方法對221份腹瀉糞便樣本進行檢測，以獲得河南省腹瀉犢牛中BAstV的感染情況。

2 結果

2.1 BAstV目的片段的擴增利用自行設計的引物從BAstV毒株的cDNA中擴增出約150 bp的片段(圖1)，經測序片段大小為157 bp，與預期相符。經BLAST檢索，與GenBank上的基因序列完全匹配，為BAstV ORF1a基因的特異性序列。

M.DL2000 DNA Marker；1.BAstV陽性樣品；2.陰性對照

2.2 實時熒光定量PCR熔解曲線重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a經擴增后，擴增產物在Tm值為84℃處出現單一波峰(圖2)，無引物二聚體和非特異性擴增峰。

1.pMD18T- BAstV-ORF1a；2.陰性對照

2.3 優化的熒光定量PCR反應體系與條件經反應體系與反應條件優化，最終確定BAstV EvaGreen實時熒光定量PCR反應體系： 2×qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 補至20 μL。最終確定的反應條件：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。

2.4 標準曲線的建立根據拷貝數計算公式計算出重組質粒為1.36×1010拷貝/μL，用ddH2O將重組質粒依次進行10倍倍比稀釋，選取1.36×109～1.36×101拷貝/μL的重組質粒作為標準品模板，依照優化后的反應體系及條件，進行EvaGreen實時熒光定量PCR擴增。結果顯示，重組質粒為1.36×101～1.36×108拷貝/μL線性關系良好(圖3)，回歸方程為y= -3.48x+36.807，相關系數R2=0.999，擴增效率是93.79%。

圖3 熒光定量PCR方法的標準曲線

2.5 熒光定量PCR的敏感性分析對重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a進行10倍倍比稀釋，用等量Nuclease-free Water作陰性對照，應用本研究建立的熒光定量PCR方法進行擴增。結果表明，熒光定量PCR所能檢出的最低拷貝數為13.6拷貝/μL(圖4)。而常規PCR最低檢出BAstV的拷貝數為1.36×103拷貝/μL(圖5)，該熒光定量PCR方法是普通PCR方法敏感性的100倍，敏感性較高。

1～9.1.36×108 ～1.36×100拷貝/μL；10.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker;1～9.1.36×108～1.36×100 拷貝/μL;10.陰性對照

2.6 熒光定量PCR的特異性分析用所建立的方法對BNoV、BCoV、BVDV的cDNA及重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a進行檢測，結果顯示該方法僅對BAstV 有擴增，其他病原及陰性對照均無特異性擴增(圖6)。

1.重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a 1.36×105 拷貝/μL；2～5.BNoV、BCoV、BVDV、ddH2O

2.7 熒光定量PCR的重復性分析以4個稀釋度的重組質粒pMD18T-BAstV-ORF1a為模板分別進行批內和批間重復性試驗，結果顯示批內Ct值變異系數(CV)為0.60%～0.91%，批間Ct值CV為0.60%～1.92%(表2)，均小于2.0%，表明該方法具有良好的可重復性。

2.8 臨床樣品的檢測采用本試驗建立的熒光定量PCR方法對221份犢牛腹瀉糞便樣本進行檢測，BAstV的陽性檢出率為18.1%(40/221)，采樣場的陽性率為100.0%(14/14)。將該方法檢出的全部陽性樣品進行測序，證實均為BAstV的基因片段。

表2 熒光定量PCR的重復性

3 討論

犢牛腹瀉是臨床上一種可引起犢牛死亡的常見綜合征，給養牛業帶來巨大的經濟損失。由于其病因復雜，及時找出致病原因，并做出準確診斷，采取相應防治措施是成功控制犢牛腹瀉的關鍵。犢牛腹瀉病因包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲以及環境等生物學因子[10-11]，其中病毒感染是引起犢牛腹瀉的重要原因，且病毒可通過急性、持續性或潛伏性等感染模式引起腹瀉類疾病[12]。盡管腹瀉犢牛糞便樣品中檢出BAstV已在世界多個地區報道，但BAstV感染或BAstV某一譜系感染與犢牛腹瀉是否存在直接相關作用，猶未可知，但BAstV對牛小腸細胞的侵襲作用已經被證實[13]。遺憾的是，本試驗并未對健康犢牛糞便樣品是否存在BAstV進行檢測，所以無法確定BAstV感染與犢牛腹瀉之間存在的直接相關作用。因此，BAstV感染對犢牛腹瀉的致病性，仍需進一步研究。

目前國內還沒有專門針對BAstV的熒光定量PCR快速診斷方法。LüTHI等[14]建立了檢測新型BAstV毒株BoAstV-CH13/NeuroS1的熒光定量PCR方法，該檢測方法使用特異性引物及其探針，對與腦炎有關的BAstV毒株能夠進行準確檢測。本試驗試圖使用上述引物及探針對腹瀉樣本中的BAstV進行檢測，但未能成功；經比對，本研究中檢出的BAstV毒株基因序列與上述探針及引物的序列同源性較低，且與BoAstV-CH13/NeuroS1毒株的基因序列同源性也較低；另外，使用熒光探針對病毒進行定量分析，該方法成本較高，不利于臨床樣本的大規模檢測，所以仍需開發新的檢測腹瀉樣本中BAstV的快速經濟的診斷方法。此外，EvaGreen作為另一種用于實時定量PCR的DNA結合染料，相較于SYBR Green Ⅰ，EvaGreen更穩定更安全，且對PCR反應的抑制性更小，在定量PCR中EvaGreen的定量效果要優于SYBR Green Ⅰ[15]。本研究根據BAstV的ORF1a基因，成功建立了基于EvaGreen的BAstV Real-time PCR檢測方法。該方法特異性強、重復性好，對臨床樣本中BAstV的最低檢出限明顯高于常規PCR檢測方法，保障了BAstV檢測結果的準確性和檢出效率，為BAstV的防控和流行病學調查提供了有力的技術手段。

近年來，隨著養牛行業的興起和養殖數量的日益增加，犢牛腹瀉和牛呼吸道疾病綜合征等病癥也突顯出來，難以控制，成為困擾養牛業的難題，這可能與病原種類增加、新發病原感染率高、混合感染嚴重等因素有關。然而，BAstV的存在及流行情況在我國并不十分清楚，國內有關BAstV的報道非常缺乏，尤其河南省BAstV的流行情況尚無相關報道。ALFRED等[16]采用RT-PCR方法檢測了我國廣西省奶水牛牛群間BAstV的感染情況，結果顯示直腸拭子樣本中BAstV的檢出率高達43.6%；田欣睿等[17]采用RT-PCR方法檢測了我國川西北地區牦牛群感染BAstV的情況，BAstV在牦牛中的感染率為5.2%。本試驗對2017年9月至2019年5月河南省14個牛場的221份犢牛腹瀉樣本進行檢測，BAstV的陽性檢出率為18.1%(40/221)，采樣場陽性率100.0%(14/14)，表明該病毒已在河南省犢牛群中流行。這一結果對河南省犢牛腹瀉的防控提供了重要參考依據。

本研究成功建立了基于EvaGreen染料的BAstV Real-time PCR檢測方法，該方法靈敏性高、特異性強、重復性好，對BAstV的最低檢出量為13.6 拷貝/μL，為BAstV的檢測和分子流行病學調查提供了新的技術手段。BAstV作為國內一種牛的新發病毒，可能是一個重要的致犢牛腹瀉病毒，應引起高度重視。