大熊貓源細小病毒病毒樣顆粒的構建與免疫原性

焦翠翠，金宏麗，馮 娜，黃 培，劉 迪，李麗娜，趙 健，王 倩，丁秋雨，楊松濤，夏咸柱，石 晶*，王化磊*

(1.長春西諾生物科技有限公司，吉林 長春130012；2.吉林大學 動物醫學學院/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春130062；3.軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春130122)

肉食動物細小病毒屬于細小病毒科,細小病毒屬，包括貓泛白細胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus,FPV)、犬細小病毒(canine parvovirus,CPV)、水貂腸炎病毒(mink enteritis virus,MEV)等，可感染犬科、貓科、鼬科、靈貓科、浣熊科等多種家養、圈養、經濟和野生動物，對動物健康和行業發展構成了嚴重威脅[1-4]。在我國，家養動物和野生動物均有細小病毒相關疫病流行的報道[5-8]。鄔捷等[7]對成都、重慶兩地動物園的大熊貓進行血清學調查，在其血清內檢出抗體，陽性率達50%，首次證實大熊貓能夠自然感染細小病毒。2012年梁萌[8]對大熊貓中分離的細小病毒基因序列進行遺傳進化分析，發現病毒VP2基因10個關鍵氨基酸位點有3個氨基酸位點與CPV一致，其余位點與FPV一致。細小病毒為單股無囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈對稱的二十面體結構[9]，基因組包括2個開放閱讀框，分別編碼非結構蛋白(NS1，NS2)以及結構蛋白(VP1，VP2，VP3)[9]。其中VP2蛋白包含刺激機體產生中和抗體的主要抗原表位[10]，VP2關鍵氨基酸位點的突變可以改變其抗原特性和宿主范圍[11]。

疫苗免疫是預防傳染病的最主要措施，對于大熊貓等珍稀瀕危野生動物，疫苗的安全性尤為重要。當前，針對細小病毒病的疫苗主要包括減毒活疫苗和滅活疫苗，減毒活疫苗存在毒力返強的風險，全病毒滅活疫苗可能存在病毒滅活不徹底的危險[12]。安全、高效的基因工程亞單位疫苗是大熊貓等珍稀瀕危野生動物疫苗研究的發展方向。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒的一個或者多個結構蛋白組裝成的天然病毒粒子[13]。VLPs形態上與天然病毒相似，但不含病毒的基因組，無復制能力，所以不具有感染性，安全性更高。與傳統疫苗相比，VLPs更容易被免疫系統識別，引起體液和細胞免疫反應[14]。本研究選用大熊貓源細小病毒的VP2基因，利用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統構建表達VP2蛋白的重組桿狀病毒，重組病毒感染昆蟲細胞使其成功組裝成VLPs，為大熊貓細小病毒病新型疫苗的研制提供前期基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DH10Bac、DH5α感受態，供體質粒pFastBac Dual以及Sf9細胞均由長春西諾生物科技有限公司保存；高保真DNA聚合酶購自全式金公司；限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Cellfectin Ⅱ Reagent轉染試劑購自Thermo公司；硝酸纖維素膜(NC膜)購自GE公司；HRP標記的羊抗鼠IgG、FITC標記的羊抗鼠IgG、BSA購于北京索萊寶科技有限公司；鼠抗犬細小病毒VP2蛋白單克隆抗體由吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室制備。

1.2 VP2基因的引物設計及PCR擴增參考大熊貓源細小病毒的VP2基因序列，根據昆蟲細胞密碼子偏愛性進行序列優化并合成。利用Primer Premier 5.0軟件對優化后的VP2序列設計引物，引物序列見表1。質粒序列優化、合成，引物合成均由上海生物工程有限公司完成。以合成的質粒為模板，利用表1中的引物分別進行PCR擴增。反應體系：ddH2O 32 μL，5×PCR緩沖液10 μL，模板1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，高保真DNA聚合酶1 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，共50 μL。反應條件：95℃預變性2 min；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環；72℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因。

表1 引物序列及產物長度

1.3 重組供體質粒及穿梭質粒的構建將PH-FPV-VP2、P10-FPV-VP2 PCR產物分別通過相應酶切位點連入供體質粒pFastBac Dual中，構建含有雙拷貝VP2基因的重組供體質粒pFBD-Panda-dVP2。將鑒定正確的pFBD-Panda-dVP2轉化DH10Bac感受態，37℃培養48 h，在含四環素、慶大霉素和卡那霉素的平板藍白斑篩選后，挑取白色菌落，提取重組桿狀病毒質粒并對其進行PCR鑒定，鑒定引物見表2，將鑒定正確的質粒命名為rBacmid-Panda-dVP2。

表2 重組桿狀病毒質粒鑒定引物序列及產物長度

1.4 重組桿狀病毒的拯救利用Cellfectin Ⅱ Reagent轉染試劑將rBacmid-Panda-dVP2轉染Sf9細胞，27℃培養72 h后出現細胞病變，收集細胞上清，獲得重組桿狀病毒rpFBD-Panda-dVP2。將rpFBD-Panda-dVP2進行連續傳代，毒種于-80℃保存備用。

1.5 間接免疫熒光鑒定將rpFBD-Panda-dVP2以MOI=0.5接種已長成單層的Sf9細胞(24孔板)，并設立正常細胞對照，于27℃培養48 h后，用70%冷乙醇室溫固定30 min，以細小病毒VP2單克隆抗體(1∶400倍稀釋)為一抗，FITC標記羊抗鼠IgG(1∶200倍稀釋)為二抗進行染色，同時加入伊文思藍(1∶300倍稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光結果。

1.6 SDS-PAGE及Western blot檢測將rpFBD-Panda-dVP2以MOI=0.5接種懸浮培養的Sf9細胞，96 h后收獲混合物。將收獲的混合物，3 000 r/min離心30 min分離細胞和上清，細胞加入25 mmol/L NaHCO3裂解后，離心收獲上清，加入5×Loading Buffer，制備上樣產物，進行SDS-PAGE電泳鑒定。

將上樣產物經SDS-PAGE電泳，轉膜至NC膜，以細小病毒VP2單克隆抗體為一抗(1∶500倍稀釋)，HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000倍稀釋)為二抗進行Western blot分析。

1.7 電鏡觀察將1.6中經NaHCO3裂解后的細胞上清中滴加飽和(NH4)2SO4至終濃度為20%，輕輕搖勻，置冰上30 min后，12 000 ×g離心30 min，收獲沉淀，用飽和EDTA重懸沉淀，進行蔗糖密度梯度(35%，45%，55%，65%)38 000 r/min離心2 h[15]。將蛋白條帶使用PBS重懸，在45 000 r/min離心2 h去蔗糖，獲得的沉淀用少量PBS重懸，用電子顯微鏡觀察Panda-VLPs形態大小。

1.8 血凝檢測在V型血凝板中，使用15 mmol/L pH6.5 PBS將混合物進行2倍倍比稀釋，每孔再加入50 μL 1%豬紅細胞懸液(含0.5%兔血清)，4℃靜置1 h后，判定樣品的血凝效價。

1.9 動物免疫試驗將1.6中處理后上清液進行稀釋，使其血凝效價為1∶211，與Gel 02佐劑等體積乳化，皮下注射免疫10周齡貓，1 mL/只，5只/組。首免后2周加強免疫1次。首次免疫后2，4，5，6周及2，3，4，5，6，7，8，9，10，12月進行采血，分離血清，通過HI試驗檢測血清中細小病毒抗體水平。方法如下：在V型血凝板中，使用15 mmol/L pH6.5 PBS將血清進行2倍倍比稀釋，每孔加入8個血凝單位的Panda-VLPs抗原(25 μL)，在37℃溫箱孵育1 h，每孔再加入50 μL 1%豬紅細胞懸液(含0.5%兔血清)，4℃靜置1 h后，判定結果。

2 結果

2.1 轉移載體的構建將擴增的兩段目的基因(PH-FPV-VP2、P10-FPV-VP2 PCR產物)分別克隆至供體質粒pFastBac Dual PH啟動子和P10啟動子下游，經NotⅠ/HindⅢ和XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定(圖1)，證明含有雙拷貝VP2基因的轉移載體pFBD-Panda-dVP2構建成功。

M.DL15000 DNA Marker；1.NotⅠ/HindⅢ酶切pFBD-Panda-dVP2；2.XhoⅠ/KpnⅠ酶切pFBD-Panda-dVP2

2.2 重組桿粒rBacmid-Panda-dVP2的構建與鑒定將鑒定正確的pFBD-Panda-dVP2轉化至DH10Bac感受態，篩選獲得攜帶雙拷貝VP2基因的重組桿狀病毒質粒rBacmid-Panda-dVP2;以p10F/p10R、pHF/pHF兩對引物對rBacmid-Panda-dVP2進行鑒定，可分別擴增出長度約為3 727，2 578 bp的產物，與理論值相符，表明rBacmid-Panda-dVP2構建成功(圖2)。

M.DL15000 DNA Marker；1.p10F/p10R引物鑒定；2.pHF/pHF引物鑒定

2.3 重組桿狀病毒的拯救與鑒定將rBacmid-Panda-dVP2轉染Sf9細胞，27℃培養72 h后出現細胞病變，即細胞變大、變圓、脫落。待細胞病變達80%左右時，收集上清獲得P1代重組桿狀病毒，提取基因組，經PCR鑒定正確，命名為rpFBD-Panda-dVP2。將P1代rpFBD-Panda-dVP2連續傳代，擴增至第3代，rpFBD-Panda-dVP2感染Sf9細胞48 h后可見明顯細胞病變(圖3)。

A.rpFBD-dVP2感染后的Sf9細胞；B.正常細胞

2.3.1間接免疫熒光鑒定 間接免疫熒光鑒定結果顯示，重組桿狀病毒rpFBD-Panda-dVP2感染的Sf9細胞可見明顯綠色熒光(圖4A)，正常Sf9細胞(圖4B)則未見特異性熒光反應，僅見到紅色細胞背景；表明VP2蛋白在細胞中得以表達，且目的蛋白可被VP2單克隆抗體特異性識別。

A.重組桿狀病毒感染的Sf9細胞；B.正常Sf9細胞

2.3.2SDS-PAGE鑒定 利用SDS-PAGE對VP2蛋白的表達情況進行鑒定，結果可見在65 kDa有明顯目的條帶，表明rpFBD-Panda-dVP2感染Sf9細胞后可成功表達VP2蛋白，且感染細胞經NaHCO3溶液處理后可獲得較單一的目的條帶(圖5)。

M.蛋白Marker；1.正常Sf9細胞；2.Panda-VLPs經NaHCO3處理后上清液

2.3.3Western blot鑒定 以鼠抗犬細小病毒VP2單克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot分析，結果顯示，目的蛋白可與細小病毒VP2單克隆抗體特異性結合，在相對分子質量約65 kDa處可見目的蛋白條帶(圖6)。

2.3.4電鏡觀察 將重組病毒rpFBD-Panda-dVP2感染Sf9細胞混合物和純化后的Panda-VLPs經電子顯微鏡觀察，結果表明重組病毒感染Sf9細胞后可成功包裝形成病毒樣粒子，其形態與天然細小病毒粒子相似，大小約為22 nm(圖7)。

M.蛋白Marker；1.rpFBD-Panda-dVP2感染的Sf9細胞；2.正常Sf9細胞

A.混合物；B.純化后的Panda-VLPs

2.3.5血凝檢測 將 rpFBD-Panda-dVP2感染細胞混合物進行血凝效價檢測，結果顯示，收獲的VLPs可成功凝集豬紅細胞，其血凝效價達1∶215(圖8)。

圖8 血凝效價檢測

2.4 動物免疫結果將Panda-VLPs輔以Gel 02佐劑后免疫幼貓，對免疫后不同時間的貓血清進行HI效價測定，結果顯示，首次免疫后2周，免疫貓體內即可產生抗細小病毒HI抗體；加強免疫后，HI抗體迅速升高，之后抗體水平基本穩定，效價持續在1∶27～1∶28之間，首免后12個月仍能檢測到HI抗體(圖9)；結果說明制備的VLPs可以有效刺激機體產生免疫反應，具有良好的免疫效果。

圖9 貓免疫Panda-FPV-VLPs后血清HI抗體效價檢測

3 討論

細小病毒粒子由60個蛋白亞基組成，其中VP2蛋白亞基約占50個，是構成衣殼蛋白的主要成分[16]。VP2蛋白包含主要的保護性抗原位點，可誘導機體產生良好的免疫反應，是疫苗研制的主要靶抗原。楊松濤等[17]以犬2型腺病毒(canine adenovirus，CAV-2)為載體構建了能表達FPV VP2蛋白的重組病毒，動物試驗結果表明，該重組病毒可以有效誘導貓產生抗FPV和CAV-2的抗體。此外，細小病毒VP2蛋白可在體外自主包裝形成VLPs，具有血凝活性。BROWN等[18]利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統表達人細小病毒VP2蛋白，發現其可以單獨組裝成類似于病毒的空衣殼。呂建強等[19]證明豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)VP2蛋白可以體外自行組裝成PPV VLPs，大小形態與活病毒相似。科研人員利用不同表達系統表達犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，均可以獲得CPV VLPs，且免疫效果良好[20-22]。本研究選用大熊貓源細小病毒的VP2基因，通過昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統表達VP2蛋白，經過間接免疫熒光、SDS-PAGE、Western blot鑒定，均表明VP2蛋白獲得成功表達，同時電鏡觀察結果證實體外表達的VP2蛋白可自主組裝成VLPs，空間結構與天然細小病毒相似，且組裝的VLPs具有較高的血凝活性。通常HI試驗被認為是細小病毒抗體檢測的金標準[23-25]。本研究將制備的VLPs免疫幼貓后，可有效刺激機體產生抗細小病毒HI抗體，免疫兩次可使機體內的HI抗體水平維持在1∶40以上至少12個月。不同動物源細小病毒刺激機體產生的抗體水平和保護能力存在差異。有文獻表明，貓體內的HI抗體水平大于1∶40即可達到保護效果[26]，犬體內產生的CPV HI抗體水平大于1∶80可起到保護效果[27]，水貂體內產生的HI抗體水平大于1∶32即可抵抗MEV的攻擊[28]。

CPV、FPV、MEV VP2蛋白具有相同的抗原成分，在血清學上具有交叉反應。STRASSHEIM等[29]研究發現針對CPV的單克隆抗體可同時識別CPV、FPV和MEV。本研究通過Western blot和間接免疫熒光驗證發現，大熊貓源細小病毒VP2蛋白同樣可被抗CPV VP2蛋白單克隆抗體識別，表明大熊貓源細小病毒VP2蛋白與CPV VP2蛋白具有相同的抗原決定簇。盡管CPV、FPV和MEV的VP2蛋白之間存在交叉保護性，但利用特異性的單克隆抗體仍能顯示其抗原差異性[30]。對影響宿主范圍、生物特性的VP2蛋白關鍵氨基酸位點分析發現，除第101位氨基酸與CPV參考序列一致外，大熊貓源細小病毒VP2蛋白的其余關鍵氨基酸位點均與FPV參考序列一致，因此根據分離的大熊貓源細小病毒VP2蛋白進行大熊貓細小病毒病新型基因工程疫苗的研制，相比其他毒株更具代表性。

疾病死亡是導致我國大熊貓數量減少、種族瀕危的主要原因，其中細小病毒病的病死率較高，也可能導致其他疾病的繼發感染。疫苗免疫是預防傳染病的最主要措施，對于大熊貓等珍稀瀕危野生動物，疫苗安全性尤為重要。當前，針對細小病毒病的疫苗主要包括減毒活疫苗和滅活疫苗，減毒活疫苗存在毒力返強的風險，全病毒滅活疫苗可能存在病毒滅活不徹底的危險[12]。本研究通過表達大熊貓源細小病毒VP2蛋白，體外組裝成與天然病毒粒子形態結構相似的VLPs，由于VLPs不含病毒核酸，具有更高的安全性。此外，VLPs免疫動物后可刺激機體產生良好的免疫反應。大熊貓源細小病毒VLPs的制備為大熊貓細小病毒病新型基因工程亞單位疫苗的創制提供了安全、高效的免疫原，為該疫苗的后期研究和開發奠定前期基礎，同時為珍稀瀕危野生動物新型疫苗的創制提供研究思路。