新疆艾比湖野鳥H1N2亞型禽流感病毒的分離鑒定及全基因組序列分析

李培東，劉慶慶，肖陳城*，陳創夫*,王 丹，依再提古麗·熱依木江，王一帆，朱 雅，王 勇，李亞玲

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.第八師瑪納斯河濕地自然保護區管理站，新疆石河子 832000)

禽流感(avian influenza,AI)又稱歐洲雞瘟，屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，于1878年(意大利)初次報道[1]。禽流感病毒(AIV)根據其表面蛋白的抗原性已鑒定出16種HA亞型和9種NA亞型，除蝙蝠起源的流感樣病毒H17N10亞型和H18N11亞型外，所有的AIV亞型最初都是在禽類宿主中分離出來的[2]。世界上第1次分離得到AIV是在1901年，而在1955年才確定AIV與人類以及哺乳動物流感病毒之間存在著關聯，在1970年左右發現水禽是AIV的基因庫[3]。自AI被報道以來，世界上許多國家和地區都陸續發生了AI的疫情，給當地的養禽業帶來了巨大的經濟損失，甚至對人類健康也造成了一定的威脅。

本研究對2017年采集自新疆艾比湖自然保護區野鳥的糞便棉拭子進行了AIV的分離與鑒定，從其中一個棉拭子樣品中分離到了1株野鳥源的H1N2亞型AIV，并對其進行了全基因組的序列分析，旨在調查野鳥中存在的AIV，為AI的防制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑總RNA急速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司；普通瓊脂糖DNA回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、反轉錄酶(SMART MMLV Reverse Transcriptase)、dNTP、Permix TaqTM、DNA Marker購自TaKaRa。

1.2 病毒的分離取2017年采集自新疆艾比湖自然保護區野鳥的糞便棉拭子100 μL，以注射器注射至9日齡雞胚的絨毛尿囊腔；接種后每日觀察雞胚死亡情況，48 h后收取尿囊液,將收取的尿囊液進行血凝試驗初步鑒定。

1.3 提取病毒RNA及反轉錄取200 μL雞胚病毒尿囊液，應用總RNA急速抽提試劑盒并根據其說明書步驟提取病毒總RNA。將提取的病毒總RNA依據SMART MMLV Reverse Transcriptase說明書反轉為cDNA，放-20℃冰箱備用。

1.4 PCR鑒定及產物純化參照自HOFFMANN等[4]設計的通用引物(由上海生工合成)和反應條件進行PCR擴增。根據聚合酶說明書配制50 μL反應體系。PCR反應程序：預變性95℃ 5 min；變性95℃30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 2 min 30 s，進行30個循環；終延伸72℃ 10 min，4℃保存。

配制1%瓊脂糖凝膠，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠。根據普通瓊脂糖DNA回收試劑盒，對PCR產物進行純化。

1.5 PCR產物克隆在微量離心管中加入pMD19-T Vector 0.2 μL、純化后的DNA 2.3 μL和Solution Ⅰ 5 μL配制10 μL反應體系，16℃連接過夜。

依據pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，并將其涂布到含氨芐的LB固體培養基中培養過夜。挑取單個菌落，接種到LB液體培養液中進行搖菌，并對菌液進行PCR鑒定。

1.6 序列測序及分析將含有目的片段的菌液送至上海生工進行測序，測序結果用NCBI進行對比分析，并用MAGA 7.0軟件繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 病毒分離經血凝試驗和PCR檢測，本試驗從2017年采集自新疆艾比湖自然保護區野鳥的糞便棉拭子中分離得到1株H1N2亞型AIV，并命名為：A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)。

2.2 分離株全基因組序列測序結果將測序后的病毒全基因序列在NCBI網站上經BLAST比對，結果顯示各基因片段分別與H1、H2、H4、H7多種亞型的AIV高度同源(表1)。

表1 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)株BLAST比對分析結果

2.3 基因組進化分析

2.3.1HA基因序列分析 分離株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)HA基因全長1 805 bp，編碼區30～1 731 bp，共1 701 bp，編碼566個氨基酸。在NCBI網站經BLAST比對分析后該毒株HA基因與毒株A/mallard duck/Georgia/11/2011(H1N1)的HA基因同源性最高，其核酸的一致性為96.12%。在MAGA 7.0上繪制系統進化樹如圖1，分析得知其屬于歐亞譜系。

該毒株的裂解位點為NIPSIQSR↓GLFGAIAGF，不含有多個連續的堿性氨基酸，符合低致病性AIV氨基酸的序列特征。毒株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)有7個潛在的糖基化位點，分別為27NNS29、28NST30、40NVT42、104NGT106、304NSS306、498NGT500和557NGS559，并未出現核苷酸突變。但其與同源性最高毒株A/mallard duck/Georgia/11/2011(H1N1)相比出現了10個氨基酸突變，其位點分別為13I-G、15S-L、137T-A、138S-N、154L-S、202A-T、203S-N、212A-T、218V-I和232V-A，其全部位于HA1。

圖1 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株HA基因遺傳進化樹

2.3.2NA基因序列分析 毒株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)NA基因全長1 484 bp，編碼區為51～1 461 bp，共1 410 bp，共編碼469個氨基酸。在NCBI網站經BLAST比對分析后該毒株NA基因與毒株A/garganey/Republic of Georgia/1/2011(H4N2)的NA基因同源性最高，其核酸的一致性為97.43%。在MAGA 7.0上繪制系統進化樹如圖2，分析得知其屬于歐亞譜系。該毒株NA基因有7個潛在的糖基化位點，分別為61NIT63、69NNT71、86NWS88、146NGT148、200NAT202、234NGT236、403NWS405。其與NA基因同源性最高的毒株A/garganey/Republic of Georgia/1/2011(H4N2)相比，存在7個氨基酸變異，分別為18T-A、86N-D、125N-S、126S-P、141N-D、192A-V和212A-V，增加一個潛在糖基化位點，即86NWS88。NA 分子中與流感病毒抗達菲類藥物相關的274( H-Y) 氨基酸位點沒有發現突變[5]，且294為N，預測對奧司他韋類藥物敏感[6]。

圖2 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NA基因遺傳進化樹

2.3.3病毒內部基因序列分析及進化 該毒株內部基因序列分析及進化顯示，NS基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-698C/2016(H7N3)有較高的同源性(圖3)，其核酸的一致性為99.33%；M基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-125OP/2015(H7N3)有較高的同源性(圖4)，其核酸的一致性為98.73%；NP基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-487OP/2016(H7N3)有較高的同源性(圖5)，其核酸的一致性為98.85%；PA基因與毒株A/mallard duck/Georgia/10/2016(H7N7)有較高的同源性(圖6)，其核酸的一致性為98.61%；PB1基因與毒株A/northern shoveler/Egypt/MB-D-695C/2016(H7N3)有較高的同源性(圖7)，其核酸的一致性為98.55%；PB2基因與毒株A/duck/Mongolia/655/2015(H2N3)有較高的同源性(圖8)，其核酸的一致性為97.15%。無疑，該毒株與其他亞型病毒發生了重組。

內部基因序列分析顯示，NS蛋白中92D突變為E可導致病毒對干擾素產生抗性[5]，而在分離株中并未檢測到該突變。除此之外，42S、149A均未出現與感染哺乳動物或致病性增強的突變[7]。但是本分離株NS基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-698C/2016(H7N3)相比139D突變為139G，該突變是否會對毒株的致病力產生影響尚未可知。M2離子通道蛋白未發生突變31S-N，顯示對金剛烷胺和金剛乙氨敏感[8]。但是本分離株與毒株A/teal/Egypt/MB-D-125OP/2015(H7N3)相比，M2蛋白發生突變77L-R。NP基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-487OP/2016(H7N3)相比出現4個氨基酸變異，分別為105L-V、119V-I、193I-L、364R-Q。PA基因97T-I、515T-A，PB1基因198K-I、317M-K、436Y-H，均未發生使該分離株毒力增強的突變[9]。PB2基因中與宿主特異性和病毒復制能力有關的627E和701D并未發生突變[10-11]，但PB2蛋白與毒株A/duck/Mongolia/655/2015(H2N3)相比出現2個氨基酸變異，分別為639D-N、464M-L。

圖3 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NS基因遺傳進化樹

圖4 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株M基因遺傳進化樹

圖5 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NP基因遺傳進化樹

圖6 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株PA基因遺傳進化樹

圖7 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株PB1基因遺傳進化樹

圖8 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株PB2基因遺傳進化樹

3 討論

AIV基因組由8個節段的單股負鏈RNA構成，編碼8種病毒蛋白[12-18]。HA是一種表面糖蛋白，它對流感病毒的毒力、免疫原性和種間傳播有著重要的意義。HA蛋白合成后信號肽被信號肽酶切除形成HA0，在宿主蛋白酶作用下裂解而激活為HA1和HA2，分別主要介導病毒與細胞膜的接觸吸附和促使病毒與細胞膜融合來完成病毒入侵細胞的過程[19]。低致病性AI的HA裂解位點由呼吸道和消化道的胰蛋白酶樣蛋白酶識別，而高致病性AI攜帶多個連續的堿性氨基酸，使其被無處不在的糖蛋白樣蛋白酶切割，導致全身性感染和高死亡率[20]。而NA酶活性的強弱會影響唾液酸受體的切割，進而影響病毒的復制使病毒表現出宿主特異性；NA基因的突變、插入或缺失都會導致酶活性的改變，使病毒突破種間障礙來引起流感的大暴發[21]。本實驗室分離的毒株HA裂解位點為NIPSIQSR↓GLFGAIAGF，不含有多個連續的堿性氨基酸；NA頸部沒有氨基酸缺失，符合低致病性AI的特征。除此之外，本分離株NS蛋白中92D，M2離子通道蛋白31S，PA基因中97T、515T，PB1基因中198K、317M、436Y，PB2基因中627E和701D均未發生突變。

艾比湖位于新疆博州地區精河縣城以北35 km處，面積大約600 km2，是新疆第一大咸水湖[22]，更是候鳥的一個重要棲息地。秋季候鳥在新疆大致有3條遷徙路線，分別是東南亞路線、印巴路線和北非路線，而艾比湖位于這3條路線的樞紐位置，是中亞鳥類遷徙的主要驛站[22]。野生水禽帶毒的現象十分普遍，更被認為是AIV的自然儲庫。調查表明艾比湖鳥類資源不僅數量眾多，而且種類豐富，幾乎占全疆的55%[23]。在野鳥遷徙過程中，病毒可以在不同野鳥體內進行不斷地進化和重配。而野鳥和家禽之間也可能存在病毒傳播[23]，當AIV由野鳥傳播到家禽的時候，病毒的變異或進化速度往往會明顯加快，其結果往往是導致家禽致死病的發生，甚至是帶來災難性的后果[24]。因此，檢測艾比湖及周邊地區野鳥的AIV帶毒情況，對預防AI的發生具有十分重要的意義。

本研究從新疆艾比湖自然保護區野鳥采集的糞便棉拭子中分離出了1株H1N2亞型的低致病性AIV。經對分離株的基因分析得知，其存在與多種亞型AIV的重配現象。而其PB2基因更是與鴨源AIV的PB2基因同源性最高，有感染家禽的潛力，值得進行進一步研究。