云南香豬PRRSV分離株ORF7基因遺傳變異分析

鄭龍龍，朱玲云，劉萍丹，趙德育，劉 佳,畢峻龍，楊貴樹，舒相華*

(1.云南農業大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.楚雄州動物疫病預防控制中心，云南 楚雄 675000)

香豬是我國優良微型地方豬種，具有體型矮小、肉質香嫩、皮薄骨細、玲瓏美觀和精靈逗人等特點，是加工制作色、香、味具全的高檔肉產品的優質原料，一般飼養5～7周齡的乳豬出欄、屠宰最為合適。云南省普遍飼養巴馬香豬，該品種源產于廣西巴馬瑤族自治縣，是一個具有悠久的飼養歷史和穩定的遺傳基因且品質優良而珍貴稀有的地方小型豬品種。由于香豬飼養時間短，常不進行豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的免疫，因此容易感染該病。通過對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株的全基因組序列進化樹進行分析，推斷HP-PRRSV毒株是由我國 CH-1a 樣PRRSV毒株演化而來的。同時2006 年豬“高熱病”也是由PRRSV變異株 (JXA1株) 引起的。

ORF7基因編碼的N蛋白具有高免疫原性和較好的保守性，至少含有5個抗原決定簇[1]，其中包括對美洲各型和歐洲各型的特異決定簇和所有毒株都保守的共同決定簇。由于這個特性，N蛋白能充當PRRSV的檢測抗原，在PRRS的診斷方面有著十分重大的意義[2-3]。因此通過研究2001-2014年國內部分毒株編碼ORF7基因可為研制 PRRSV 重組抗原和疫苗奠定理論基礎。

本試驗通過對云南香豬體內分離得到的PRRSV YN-2XZ1(GenBank序列號： 1776184) 和YN-3XZ2( GenBank序列號：1776193)毒株ORF7 基因進行克隆與序列分析,并與 GenBank 中公布的國內2001-2014年部分PRRSV 毒株的ORF7基因核苷酸序列進行同源性分析，為深入研究該毒株的遺傳變異及其生物學特性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源采集云南省6個自治州20只1月齡疑似PRRS癥狀的香豬，臨床出現雙眼腫脹、有眼屎，呼吸困難、消瘦、腹瀉、咳嗽、精神沉郁、食欲不振等癥狀，剖檢可見肺臟出血、腹股溝淋巴結明顯水腫出血等變化。

1.2 細胞及其他試劑Marc-145細胞購自上海中科院細胞庫；DMEM細胞培養液、胎牛血清、雙抗、胰酶和PBS購自Hyclone公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、EasyScript Reverse Transcriptase(M-MLV,RNaseH-)購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；其他試劑由云南農業大學動物科技學院傳染病實驗室提供。

1.3 樣品處理取100 mg肺臟、50 mg淋巴結進行混合研磨，加入2 mL PBS液進行漩渦振蕩，反復凍融3次，10 000 r/min離心30 min，取上清液1 mL加入100 μL雙抗，4℃靜止30 min。

1.4 病毒分離取500 μL樣品處理液加入長至80%的Marc-145細胞中培養2 h，使用含5%胎牛血清的DMEM培養基進行盲傳。第1代盲傳后凍融3次，80 000 r/min離心4 h，取500 μL加入長至80%的Marc-145細胞中培養2 h，使用含5%胎牛血清的DMEM培養基進行盲傳，逐日觀察細胞病變(CPE)。

1.5 分子生物學鑒定參考段博芳等[4]方法進行ORF7基因PCR擴增，P1：5′-AATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′;P2：5′-TCATGCTGAGGGTGATGCTG-3′，目的片段為330 bp。

1.5.1ORF7基因擴增及克隆 使用DNA提取試劑盒提取組織樣品總DNA，根據PCR試劑說明書優化反應體系及條件，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，上游和下游引物終濃度為0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板300 ng(1.5～2.0 μL)，加水補足25 μL。PCR反應條件:94℃ 3 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，30個循環；72℃ 5 min 。取8 μL PCR擴增產物與適量上樣緩沖液混合后，在120 V電壓條件下用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，30 min后在凝膠成像系統觀測結果。將陽性PCR產物經切膠回收后與pMD18-T Vector進行連接反應，轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌株，擴大培養，提取質粒，并使用限制性內切酶進行酶切鑒定。

1.5.2序列測定與分析 將鑒定為陽性的菌種進行測序分析，使用DNAStar和MEGA 4.0等生物學軟件分別對所獲得基因序列進行位點突變和遺傳進化分析，并與國內外參考序列進行比較并繪制遺傳進化樹，參考序列見表1。

表1 分析所用的PRRSV毒株參考序列及其來源

1.5.3磷酸化分析 使用在線NetPhos 2.0 Server軟件進行磷酸化預測，以磷酸化概率大于等于50%為有效數值，低于50%為無效數值，預測 ORF7基因編碼的氨基酸磷酸化的可能性，為開發磷酸化抗體和基因突變研究提供理論依據。

1.5.4TCID50測定 取6孔細胞板中已長至單層的Marc-145細胞,胰酶消化稀釋至1.0×105cell/mL的細胞懸液,96孔細胞培養板中每孔加入細胞懸液100 μL,靜置于37℃、5% CO2培養箱中培養60 h，至細胞長至96孔板的80%，用含5%胎牛血清的DMEM培養基對病毒原液進行10倍倍比稀釋，以10-1～10-9梯度向Marc-145細胞中加入病毒液，每一稀釋度設6個重復,每孔接種100 μL。設6個孔為正常對照。置37℃、5% CO2培養箱中培養，持續觀察120 h，結果按 Reed-Muench法計算TCID50。

1.5.5免疫印跡(WB)鑒定 初始1×105cells/mL的Marc-145細胞培養60 h后，使用毒力為200 TCID50/100 μL的毒株YN-2XZ1和YUN-3XZ2毒株接毒培養48 h，此時出現50%CPE，用PRRSV CH-la株的核衣殼蛋白( N蛋白)單抗進行WB試驗。SDS配體膠60 V電泳70 min，90 V電泳40 min；60 V條件下使用0.22 μm PVDF膜，轉膜1 h，鼠源N蛋白單克隆一抗(1∶100)4℃孵育10 h，PBS洗滌(10 min/次)3次;羊抗鼠二抗(1∶4 000)常溫孵育2 h，PBS洗滌(10 min/次)4次，化學發光法檢測WB結果。

2 結果

2.1 病毒致CPE觀察將處理過的病料接種于Marc-145細胞，培養至第2代48 h時出現典型CPE，細胞聚集成叢、 固縮、變圓、部分細胞緊縮呈索狀；72 h時表現為破碎、脫落(圖1)。正常細胞未見異常。

A.正常Marc-145細胞;B.YN-2XZ1毒株72 h CPE;C.YN-3XZ2毒株72 h CPE

2.2 分子生物學結果

2.2.1ORF7基因擴增 細胞培養物經凍融3次后，提取總RNA，經核酸定量后使用100 ng進行RT-PCR擴增，用8 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，YN-2XZ1、YN-3XZ2毒株PCR擴增均在相近位置有1條帶，與預期330 bp相符(圖2)。

1.YN-2XZ1毒株PCR產物;2.YN-3XZ2毒株PCR產物;3.陰性對照;M.DL1000 DNA Marker

2.2.2免疫印跡(WB)鑒定 6孔板鋪滿80% Marc-145細胞時接種PRRSV 60 h，此時出現50%CPE。使用PBS洗滌的PRRSV CH-la株的核衣殼蛋白( N蛋白)單抗進行WB試驗可見YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株均具有特異性的信號,正常組檢測不到信號(圖3)。

圖3 PRRSV N蛋白WB檢測結果

2.2.3TCID50結果 使用96孔細胞板接種細胞培養物培養120 h后，按Reed-Muench法計算得出YN-2XZ1毒株的半數細胞感染力106.75TCID50/100 μL，YN-3XZ2毒株的半數細胞感染力106.05TCID50/100 μL。

2.2.4ORF7基因重組質粒酶切鑒定結果 將切膠回收純化的ORF7基因的PCR擴增產物(330 bp)在4℃條件下經過12 h連接pMD18-T載體，轉化入感受態細胞DH5α中，37℃振蕩培養12 h后提取重組質粒進行酶切鑒定，用50 ng重組質粒經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到2個大小分別為2 700,382 bp的目的片段，與預期相符，提示成功獲得重組質粒(圖4)。

1.YN-2XZ1毒株重組質粒酶切;2.YN-3XZ2毒株重組質粒酶切；M.DL1000 DNA Marker

2.2.5ORF7基因同源性分析 測序結果顯示，試驗獲得的2株PRRSV ORF7基因長度為330 bp，編碼110個氨基酸。利用生物學軟件DNAStar對所獲得的2株PRRSV ORF7基因序列與其他國內30條序列進行核苷酸同源性分析。結果表明，此次從香豬體內分離出的YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株之間ORF7基因同源性為99.7%。YN-2XZ1毒株與國內2001-2014年參考序列核苷酸同源性為95.2%～100.0%，其中與2001-2005年參考序列核苷酸同源性分別為96.1%(CH-1a，2001),95.2%(CH2002，2002),95.2%(CH2003，2003),95.2%(CH2004，2004);與2006-2014年參考序列核苷酸同源性為98.5%～100.0%，與經典的美洲VR-2332毒株核苷酸同源性為94.0%。YN-2XZ2毒株與國內2001-2014年參考序列核苷酸同源性為94.9%～100.0%，與2001-2005年參考序列核苷酸同源性分別為95.8%(CH-1a，2001),94.9%(CH2002，2002),94.9%(CH2003，2003),94.9%(CH2004，2004);與2006-2014年參考序列核苷酸同源性為96.7%～100.0%，與經典的美洲VR-2332毒株序列核苷酸同源性為93.7%。

2.2.6遺傳進化分析 遺傳進化分析結果顯示,國內毒株在2002-2004年與CH-1a毒株在一個分支，2005-2014年毒株在一個分支，均與美洲毒株VR-2332處于不同分支。本次獲得的2株PRRSV與國內流行的變異PRRSV毒株ORF7基因進化同步(圖5)。

圖5 PRRSV ORF7基因遺傳進化分析

2.2.7ORF7基因氨基酸突變分析 將獲得的2株PRRSV ORF7基因編碼的氨基酸序列和1999年公布的VR-2332毒株及我國2001-2014年公布的序列翻譯的相應氨基酸序列進行比較(表2)。YN-2XZ1毒株和YN-3XZ2毒株ORF7基因編碼的氨基酸無差異，與CH-1a毒株ORF7基因編碼的氨基酸相比32位存在賴氨酸替換為精氨酸，35位存在絲氨酸替換為組氨酸，77位存在蘇氨酸替換為丙氨酸，99位存在組氨酸替換為谷氨酰胺，103位存在纈氨酸替換為丙氨酸。

CH-1a毒株與國內2002-2014年毒株ORF7基因編碼的氨基酸相比25位賴氨酸在2005年替換為精氨酸，32位賴氨酸在2006年、2007年、2009年、2011-2014年替換為精氨酸(R)，35位絲氨酸在2006-2014年替換為天冬酰胺，40位天冬氨酸在2005-2014年替換為組氨酸，55位精氨酸在2002-2004年替換為脯氨酸，75位蘇氨酸在2011年替換為丙氨酸，77位蘇氨酸在2005-2014年替換為丙氨酸，95位組氨酸在2006-2007年、2009-2014年替換為谷氨酰胺，103位纈氨酸替換為丙氨酸。

CH-1a毒株與美洲毒株ATCCVR-2332 ORF7基因編碼的氨基酸相比35位天冬酰胺替換為絲氨酸(表2)。

2.2.8N蛋白磷酸化分析 見表3。使用在線軟件NetPhos 2.0 Server對參考序列及本次分析毒株序列進行磷酸化預測得出：2001-2005年22,35,63,85,103位絲氨酸有67.4%～99.8%的概率被磷酸化；45,54位蘇氨酸有50.1%～93.6%概率被磷酸化，說明這5個位點極易發生突變。2006-2014年35位絲氨酸磷酸化概率低于50%，趨于穩定。

表2 ORF7基因片段中發生置換的氨基酸

3 討論

本試驗成功從香豬體內分離出2株PRRSV，均具有較高的致細胞病變效應，第2次傳代即可造成Marc-145 細胞CPE，第2代細胞培養物進行半數細胞感染力測定，按Reed-Muench法得出YN-2XZ1毒株的半數細胞感染力106.75TCID50/100 μL，YN-3XZ2毒株的半數細胞感染力106.05TCID50/100 μL。2006年童光志等[6-9]從全國12個省市48個疑似PRSS發病豬場采集的樣品研究表明，2006年前PRRSV分離毒株必須經原代巨噬細胞(PAM)傳代后才能適應Marc-145細胞，從而產生顯著CPE。在2006年暴發HP-PRRSV時分離出的15株PRRSV在Marc-145細胞上第1代盲傳即可產生CPE，隨后在我國分離的PRRSV毒株均表現出不需PAM細胞傳代，盲傳1～5代直接適應Marc-145細胞。本試驗從香豬體內分離的PRRSV YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株需經1次傳代才能適應Marc-145細胞，產生CPE，致病力相對2006年HP-PRRSV顯著下降，提示云南香豬群體中PRRSV可能不具有高暴發性和高致病力，不會引起重大經濟損失和社會恐慌，但仍需對此加以關注。豬是PRRSV的唯一宿主，目前主要以疫苗接種來進行預防，免疫失敗是造成PRRSV大規模流行和重大經濟損失的主要原因。范阿春等[11-13]對云南省PRRSV的血清學及危害情況進行調查分析得出云南省PRRSV免疫后抗體陽性率為82.76%～100.0%，表明云南省PRRSV免疫狀況較好，暴發大規模PRRSV的可能性較小，與本研究的推斷相同。但是由于香豬飼養時間短，免疫接種情況較差，因此仍然面臨PRRSV的威脅，并有可能傳染給大規模飼養的家豬，造成重大經濟損失的可能性依然存在，因此需要對香豬PRRSV感染狀況進行關注，以防止其散毒并造成家豬的大規模感染。

表3 ORF7基因編碼氨基酸磷酸化分析(磷酸化概率) %

對CH-1a毒株與2006-2014年HP-PRRSV毒株序列分析得出：CH-1a毒株55位精氨酸替換為脯氨酸，77位蘇氨酸替換為丙氨酸，103位纈氨酸替換為丙氨酸；使用CH-1a毒株制備的單克隆N蛋白抗體進行WB試驗，仍然可以檢測到目的條帶，提示55，77，103位氨基酸的替換不影響使用WB的方法檢N蛋白。使用在線軟件NetPhos 2.0 Server對ORF7基因編碼的氨基酸進行磷酸化分析得出：參考毒株和此次分離毒株的54位蘇氨酸和85位絲氨酸磷酸化可能性高于90%，有較高的突變可能性，因此該位點具備較高的可能性通過定點突變獲得單克隆磷酸化抗體，可以用于區別野毒株和疫苗毒株[13-15]。

2005年前N蛋白35位絲氨酸磷酸化概率為67.4%～99.8%，2006-2014年N蛋白35位絲氨酸磷酸化概率低于50%，在2006年國內暴發HP-RRSV至今，各省份主要流行HP-PRRSV，提示該位點氨基酸不易于磷酸化可能與 NSP-2蛋白基因缺失從而引起HP-RRSV有關[16-18]，但需要進一步研究證實。N蛋白中含有類似于核定位信號(nuclear localzation signal，NLs ) 的保守的堿性決定簇。2009年李吉達等[19]對遼寧、吉林、河北、山東、河南、江蘇、浙江、廣西等省PRRS疫情進行跟蹤調查，并分離出11株PRRSV毒株，通過分析指出N蛋白Pat7基序的突變可能會影響PRRSV的核定位，與本研究結果有相近之處，需要進一步研究加以驗證。

本試驗對及時掌握PRRSV ORF7基因的遺傳變異，了解N蛋白免疫原性和疫苗保護效率，為有效研發新疫苗及臨床用疫苗的選擇等提供了理論依據，并為全面預防和控制本病提供支持。隨著人們對生活質量的重視與生活品質的追求，以及地方品種資源的開發，云南省及國內其他省市的香豬數量將會在未來顯著增加，因此很有必要對存在于香豬群體中的PRRSV毒株進行分子流行病學研究，以了解流行狀況和基因變異，對目前最為有效的疫苗預防方式提供高效的選擇依據具有重要的實際意義與參考價值。