赤水烏骨雞不同產蛋期SPIA1基因的差異表達研究

羅韋，李輝*，陳林，葉濤，黃錫陽，司宗貴

(1. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；4. 貴州竹香雞養殖有限公司，貴州 赤水 564708)

赤水烏骨雞是貴州省赤水市的地方家禽品種[1]。赤水烏骨雞產綠殼蛋，蛋具有低膽固醇、低脂肪的特性，富含硒、鐵、鋅等多種微量元素[2]。早期遺傳學研究發現，雞蛋綠殼性狀是單基因(O基因)控制的常染色體顯性遺傳性狀[3]，在選育過程中雜合體也表現為綠殼性狀，所以采用表型選擇方法選育周期較長[4]。王哲鵬等[5]研究發現雞3號染色體上EAV-HP的長末端重復序列反向插入到雞的1號染色體SLCO1B3基因的啟動子區，促使SLCO1B3基因過量表達，導致蛋殼呈現綠色。目前，已確定SLCO1B3基因為蛋殼呈現綠色的主效基因，但是實際生產中，盡管純合子的綠殼蛋雞都產綠殼蛋，但蛋殼的綠色程度卻深淺不一[6]，導致這一現象的原因可能與其他影響蛋殼綠色的微效基因有關。本課題組陳林[7]對300日齡赤水烏骨雞的蛋殼腺進行了轉錄組測序，篩選出絲氨酸蛋白酶抑制劑1基因(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin),member 1,SPIA1)為蛋殼綠色深淺的上調基因。

SPIA1基因最早是在原雞身上發現的，目前關于SPIA1基因的研究未見報道。本研究為了驗證轉錄組測序的結果，以SLCO1B3基因作為分型基因，對赤水烏骨雞母雞進行基因分型，進而根據基因型及蛋殼顏色的深淺對赤水烏骨雞進行分類，然后檢測不同產蛋期不同蛋殼綠色深淺的赤水烏骨雞母雞蛋殼腺和肝臟中SPIA1基因的表達量，以期發現SPIA1基因的表達量與蛋殼綠色深淺之間的關系，同時鑒定與綠殼蛋顏色變異相關的基因，為綠殼蛋的遺傳機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

赤水烏骨雞由貴陽市綠源有限公司種雞場提供，隨機挑選出180、360、540日齡的品種特征明顯、長勢相近、健康無病的赤水烏骨雞母雞。

根據SLCO1B3基因設計引物，利用雙重PCR對赤水烏骨雞進行基因分型，選留綠殼純合型和綠殼雜合型，觀察每只雞每天的產蛋時間及蛋殼顏色連續2周，按照基因型和蛋殼綠色的深淺分為6類：純合子深綠色、純合子淺綠色、純合子淡綠色、雜合子深綠色、雜合子淺綠色、雜合子淡綠色。每種類型選擇產蛋顏色重復性較好，產蛋時間比較規律的雞各3只，在產蛋前2.5～3 h屠宰，屠宰后采集肝臟和蛋殼腺各20 g，用生理鹽水沖洗并用錫箔紙包裹后迅速放入液氮罐內，轉至-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

在GenBank中檢索到雞SPIA1基因和SLCO1B3基因mRNA的序列(兩個基因的登錄號分別為NM_001277493.1和NM_001318449.1)，運用Primer Primer5設計引物，引物由貴陽春滿谷生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

SLCO1B3基因的PCR擴增體系為20 μL，其中DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix(購自天根生化科技(北京)有限公司)10 μL，加ddH2O補足20 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；35個循環(94 ℃變性30 s，退火溫度51.3 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，在凝膠成像系統下觀察基因型。

SPIA1基因的PCR擴增體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix 10 μL購自天根生化科技(北京)有限公司，加ddH2O補足20 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；35個循環(94 ℃變性30 s，退火溫度52.1 ℃，退火時間35 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.2.2 蛋殼原卟啉和膽綠素的測定

測定方法參考劉敬壽等[8]和卜小雁[9]的方法。稱取原卟啉0.36 mg，膽綠素0.26 mg，溶解于6 mL溶劑中，溶劑由濃鹽酸和甲醇按1∶2的比例配制而成，漩渦振蕩，避光保存12 h，分別制成原卟啉和膽綠素的標準原液[8]。將原液稀釋成2、4、8、16、32、64、128、256倍，利用紫外分光光度計分別測定在412和680 nm處蛋殼溶解液的吸光值[8-9]。

1.2.3 RNA提取及逆轉錄成cDNA

本試驗采用Trizol法提取總RNA，并將總RNA濃度稀釋至1 000 ng/μL，根據逆轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR

對不同產蛋期的赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中SPIA1基因的表達量，本試驗運用實時熒光定量PCR法進行檢測。采用20 μL體系：SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL；反應條件按照說明書進行。

1.2.5 數據統計與分析

運用EXCEL和SPSS 18.0軟件對本試驗的所有數據進行統計和分析，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01，結果采用“平均數±標準差”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 SLCO1B3基因的PCR擴增

結果如圖1所示：純合子綠殼(SL/SL)產物片段大小為884 bp、雜合子綠殼(SL/W)為884和732 bp、純合子非綠殼(W/W)為732 bp，與目標片段大小一致。

2.2 蛋殼膽綠素含量分析

表2顯示，在對180日齡不同基因型的不同綠色蛋殼進行膽綠素含量測定和分析時發現：同一基因型中蛋殼綠色越深其膽綠素含量越高，且達到了極顯著差異的水平(P<0.01)；蛋殼顏色相同時，雜合子和純合子間蛋殼膽綠素含量不存在顯著差異(P>0.05)。

1、2. 非綠殼純合子；3、4. 綠殼雜合子；5、6. 綠殼純合子；7. DL 2000 DNA Marker

表2 180日齡不同綠色蛋殼的膽綠素含量 mol/L

2.3 SPIA1基因的差異表達與蛋殼顏色深淺的關系分析

2.3.1 赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達情況

表3結果顯示，基因型相同時，蛋殼顏色越深，則SPIA1基因在其蛋殼腺中的表達量就越高。具體表現為深綠色極顯著高于淺綠色和淡綠色(P<0.01)，淺綠色與淡綠色間不存在顯著差異(P>0.05)，但是淺綠色中的表達量高于淡綠色中的表達量。

表3 SPIA1基因在蛋殼腺中不同顏色間的差異表達

蛋殼顏色相同時，SPIA1基因在不同基因型的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達情況為：在360日齡，蛋殼顏色為深綠色時，SPIA1基因在純合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達量極顯著高于雜合子(P<0.01)；在540日齡，蛋殼顏色為深綠色時，SPIA1基因在純合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達量顯著高于雜合子(P<0.05)。其余情況下，SPIA1基因在純合子和雜合子赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達量不存在顯著差異(P>0.05)。

圖2結果顯示，純合型深綠色或雜合型深綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達量均極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淺綠色或雜合型淺綠色的條件下，180日齡和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達量均顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淡綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達量顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；雜合型淡綠色的條件下，不同日齡間不存在顯著差異(P>0.05)，但180和540日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達量均高于360日齡。

注：若達到極顯著水平，則兩圖柱標注不同大寫字母(P<0.01)；若達到顯著水平，則標注不同小寫字母(P<0.05)；若不存在顯著關系，則不標注字母(P>0.05)。下同

2.3.2 赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達情況

表4結果顯示同一基因型的赤水烏骨雞中，產蛋的蛋殼綠色越深，SPIA1基因在其肝臟中的表達量就越高。具體表現為深綠色極顯著高于淺綠色和淡綠色(P<0.01)，淺綠色高于淡綠色，但是沒有達到顯著差異(P>0.05)；360日齡時，雜合子的赤水烏骨雞中SPIA1基因在肝臟中的表達量表現為深綠色顯著高于淺綠色(P<0.05)，深綠色與淡綠色間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 SPIA1基因在肝臟中不同蛋殼顏色間的差異表達

蛋殼顏色相同時，360日齡，深綠色蛋殼的條件下，SPIA1基因在純合子的赤水烏骨雞肝臟中的表達量顯著高于在雜合子中的表達量(P<0.05)；其他情況下都表現為蛋殼顏色相同時，SPIA1基因在純合子和雜合子赤水烏骨雞肝臟中的表達量不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3結果顯示，純合型深綠色或雜合型深綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達量均極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淺綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達量顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；雜合型淺綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達量極顯著高于360日齡(P<0.01)，180和540日齡間不存在顯著差異(P>0.05)；純合型淡綠色或雜合型淡綠色的條件下，180和540日齡的赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的表達量均顯著高于360日齡(P<0.05)，180和540日齡間都不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同日齡赤水烏骨雞肝臟中SPIA1基因的差異表達

3 討論

蛋殼膽綠素是在肝臟中合成并由殼腺部分泌的[9]。相關研究顯示，蛋殼顏色是可遺傳性狀，且遺傳力較高，蛋殼顏色的遺傳力為0.58～0.76[10-11]。蛋殼顏色是由沉積于蛋殼中的色素引起的，原卟啉和膽綠素是兩種主要的蛋殼色素[12]，綠殼蛋的綠色主要是由膽綠素的沉積引起的[13-14]。因此，本試驗收集180日齡的蛋殼測其膽綠素含量，并分析了膽綠素含量與蛋殼顏色之間的關系，結果顯示蛋殼綠色越深其膽綠素含量越高，對SPIA1基因的表達量與蛋殼中膽綠素的含量進行相關性分析發現呈極顯著正相關，與轉錄組測序結果SPIA1基因為蛋殼綠色的上調基因一致。

不同產蛋期的赤水烏骨雞蛋殼腺和肝臟中SPIA1基因的差異表達分析發現，無論是純合子還是雜合子的赤水烏骨雞，不同產蛋期SPIA1基因的表達量均存在差異。其中360日齡時的表達量顯著低于180和540日齡，180與540日齡間差異不顯著，造成這一現象的原因有待于進一步研究。白激榮[15]的研究顯示，由于綠殼蛋的色素是在肝臟中合成的，如果合成速度較低，產蛋率提高就會使得單個個體綠色變淺，這與本研究數據顯示的結果一致。同時，相關研究顯示，EVP-HP插入會使得綠殼主效基因SLCO1B3基因在綠殼蛋雞蛋殼腺中高表達，同時減弱了其在肝臟中的表達[16]。本試驗發現赤水烏骨雞蛋殼腺中SPIA1基因的表達量明顯高于肝臟組織，這與綠殼主效基因SLCO1B3基因的表達特點相似。基于以上結果，推測SPIA1基因可能是影響蛋殼綠色的微效基因。關于SPIA1基因的遺傳機制尚不清楚，后續需對該基因進行深入研究。

4 結論

SPIA1基因在赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達量均表現為純合子高于雜合子，在不同基因型都表現為隨蛋殼綠色加深SPIA1基因的表達量增高，與本課題組前期轉錄組測序的結果顯示SPIA1基因為蛋殼顏色的正調控基因相符合，并且與本研究相關分析結果顯示的SPIA1基因的表達量與蛋殼膽綠素含量呈極顯著正相關一致，推測該基因可能為綠殼蛋顏色的正調控基因，其作用機理有待進一步研究。