小鼠肝再生時線粒體蛋白Mic60/OPA1與能量供應的關系

石永泉，劉煒，王柯

（1.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧 大連 116044；2.大連醫科大學附屬第一醫院中醫科，遼寧 大連 116011；3.大連醫科大學附屬第二醫院臨床營養科，遼寧 大連 116023）

肝切除術術后肝衰（post hepatectomy liver failure，PHLF）發生率約為28%，死亡率約為27%，遠高于非PHLF患者的死亡率[1]。良好的肝再生是PHLF恢復的重要因素，穩定的能量供應對肝再生至關重要，線粒體嵴膜（cristae membrane，CM）錨定的呼吸鏈復合體是能量（ATP）生成的主要裝置。CM形態可決定ATP合成效率[2]。Mic60和OPA1是主要的CM形態調控蛋白[3]，其表達水平的變化與多種病理生理狀態相關[4-6]。目前，關于肝再生中Mic60和OPA1與ATP供應的關系的研究較少。本研究旨在觀察殘余肝組織Mic60 和OPA1水平與ATP含量的關系，為改善PHLF預后提供新思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 C57/6J SPF雄性10周齡WT小鼠購自大連醫科大學SPF中心。體視顯微鏡（wf10/20，寧波永新）；七氟烷（上海恒瑞）；Mic60（ab110329，Abcam）；OPA1（ab157457，Abcam）；HRP 標記山羊抗兔 IgG（#31460，thermoFisher）；COX IV（WL01794）、PCNA（WL02208）、兔抗小鼠IgG-HRP（WLA024）、羊抗兔IgG-HRP（WLA023）、線粒體蛋白提取試劑盒（WLA034a）、BCA 試劑盒（WLA004）購自萬類生物；DAB 顯色液（DA1010，Solarbio）；增強型ATP檢測試劑盒（S0027，碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 PH模型 PH模型制作在體視顯微鏡下完成。課題組前期發現70%PH小鼠7 d生存率可達100%，85%PH組的生存率也很高，因此，本實驗選擇85%PH作為起始切除比例。將小鼠隨機分為對照組（Sham）、85%PH 和 90%PH 組，每組 18 只，每組10只用于生存分析。術前過夜不禁食水。七氟烷持續性吸入式麻醉。手術方法：腹部正中縱行切口，長約2～2.5 cm，暴露整個上腹部。顯微剪離斷鐮狀韌帶、肝胃韌帶、左外葉與右側膈肌韌帶，游離肝左外葉和肝中葉，5-0 慕絲線結扎中葉、左外葉和右下葉后切除。離斷肝周韌帶游離整個尾葉。若制作85%PH 模型，則結扎并切除尾葉；若制作90%PH 模型，則結扎右上葉并切除。切除后觀察肝切面無滲血且殘余肝無變暗后，4-0 帶針線逐層關腹，消毒切口。Sham 組小鼠開腹放置25min 后直接關腹。術畢小鼠背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.5 mL 后置于復溫盒。每組10 只用于統計7 d 生存率，其他小鼠術后24 h取殘余肝組織用于后續指標分析。前期發現術后24 h 85%PH小鼠肝組織再生開始明顯增強，因此，本研究選擇術后24 h作為時間研究點。

1.2.2 免疫組織化學染色 PCNA一抗濃度1∶300。每只小鼠的切片在光鏡400 倍視野下隨機挑選2 個視野，計數每個視野中的陽性細胞數（n1）和總細胞數（n）的比值均數，即為PCNA陽性百分率。

1.2.3 Western blot 線粒體蛋白的提取嚴格按照說明書操作：稱取肝組織50～100 mg，加入1 mL 試劑A，轉入1 mL 玻璃勻漿器中抽拉20 次，4 ℃，1 000 g 離心10 min。上清移至新EP管中，4 ℃，10 000 g離心20 min。將沉淀重懸于試劑B中，4 ℃，10 000 g 離心 10 min，重復 3 次，所得沉淀于試劑 C中裂解即得線粒體蛋白。全程冰上操作。BCA 法測定蛋白濃度。

一抗稀釋比例：Mic60和COX IV為1∶500，OPA1為1∶2 500。二抗稀釋比例均為1∶5 000。ECL法曝光顯影，凝膠圖象處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析條帶光密度值。

1.2.4 ATP 含量測定 按試劑盒說明書操作：每組取3 只小鼠肝組織，冰上分別加入150 μL 裂解液，玻璃勻漿器勻漿 20 次，4 ℃，12 000 g 離心 5 min，留上清。利用 ATP 標準品繪制標準曲線，96 孔板加入100 μL ATP 檢測工作液，放置5 min，每孔加入40 μL 樣品，每個樣品設置3 個復孔，化學發光儀測定RLU值。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，生存率比較采用one-way ANOVA，其余指標比較采用非配對t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 7 d生存率 Sham組小鼠術后7 d全部存活。85%PH組術后第2、3天死亡3只，生存率為70%。90%PH小鼠術后24 h內全部死亡。死亡小鼠解剖均未發現明顯出血現象，見圖1。

圖1 PH小鼠術后7 d生存率

2.2 85 %PH組肝再生水平明顯升高 HE染色顯示兩組肝組織均無壞死，85%PH 組脂肪化明顯（見圖2A），符合再生肝特點。85%PH組PCNA陽性率為0.043，高于Sham組的0.029（見圖2A和2B），差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 PH小鼠術后24 h肝組織HE染色和PCNA表達情況（400×）

2.3 85%PH肝組織ATP含量明顯升高 85%PH肝組織ATP含量為9.74 nM/mg，高于Sham 組的5.48 nM/mg，差異有統計學意義（n=4，P＜0.05），見圖3。

2.4 85 %PH 肝組織Mic60 表達水平明顯降低 85%PH 組Mic60 水平為0.58，低于Sham 組的1.03，差異有統計學意義（n=6，P＜0.05），見圖4B；85%PH 組 OPA1 水平為 1.02，低于Sham 組的1.51，差異無統計學意義（n=6，P=0.0502），見圖4C。

圖3 術后24 h肝組織ATP含量

圖4 術后24 h肝組織Mic60和OPA1表達水平

3 討論

本研究結果顯示，85%PH生存率為70%，顯著高于既往研究[7]，術后24 h 85%PH 殘余肝再生水平顯著升高。85%PH 肝組織ATP含量與肝再生程度呈正相關，高能量供應的機制值得探討，若能找到干預靶點應用于90%PH 組，或可提高其生存率。

線粒體為細胞增殖和功能維持提供主要所需能量，且與PH術后肝功能恢復相關[8]。線粒體CM在不同生理狀態下呈現不同形態。細胞呼吸時CM 變長，凋亡時CM 變寬[9]。CM 形態在不同病理狀態下的作用機制及其調控屬于較新研究領域，其變化可以改變線粒體超微結構中的酶活性，影響細胞能量代謝[2]。CM形態受多種蛋白調控，Mic60和OPA1是重要成員。降低和過度表達Mic60 能夠導致嵴連接點數量變化[10-11]。缺乏OPA1 的線粒體缺少嵴結構[12]。本研究結果顯示，85%PH 肝再生能力強、ATP 含量高，而 Mic60 和 OPA1 的表達明顯下降。

有研究顯示，Mic60 并非其保護性因素，肥厚性心肌病患者心臟的Mic60 表達水平升高近4 倍，在心肌中特定過表達Mic60 的小鼠心肌肥厚程度更高，ROS 生成量更多而氧化磷酸化活性降低[13]。因此，不排除85%PH 組Mic60 降低是促進能量供應的因素，這或可作為PHLF 的干預靶點。之后可在細胞水平改變其表達量，觀察細胞能量代謝的變化，結合電鏡觀察CM形態變化，進一步探索其中的機制。