抗核抗體譜IgG檢測酶聯免疫吸附法試劑盒的臨床試驗

王思英，楊湘越

（1.福建醫科大學附屬第一醫院輸血科，福建 福州 350005；2.聯勤保障部隊第900醫院檢驗科，福建 福州 350001）

抗核抗體譜是人體各種核成分抗體的統稱，這些抗體主要針對細胞核中的抗原成分。系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血液中存在大量的抗核抗體譜，不具有種屬和器官特異性，可與各種細胞核發生反應[1]。現已證實抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）對很多自身免疫性疾病有診斷價值[2]，是系統性風濕性疾病的重要診斷標志物[3-5]，如紅斑性狼瘡、系統性硬化癥、混合性結締組織病、原發性干燥綜合征和多發性肌炎-皮肌炎等[6]。目前批準上市的抗核抗體檢測試劑盒較多，且在臨床醫院得到了廣泛使用，但基層醫院因成本等原因大多沒有條件開展。為推廣國產抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（ELISA）的應用，本研究以蘇州浩歐博生物醫藥有限公司生產的抗核抗體篩查試劑盒（注冊證號：蘇械注準20152401357）和INOVA Diagnostics，Inc.生產的抗核糖體P 蛋白抗體檢測試劑盒（注冊證號：國械注進20142406218）為對照試劑，以EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG生產的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（ELISA）（注冊證號：國械注進20162400117）為第三方試劑，對歐蒙（杭州）醫學實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法，擬注冊）進行臨床驗證，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 標本來自2017 年11 月至2018 年3 月本院常規檢測的剩余血清樣本，在≤-20 ℃的低溫條件下長期保存，且樣本信息完整。歐蒙（杭州）醫學實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）臨床試驗，已通過中國人民解放軍聯勤保障部隊第900醫院的倫理審查，并批準同意。臨床試驗前申請人已與本臨床試驗機構簽署協議確定合作關系，協議內容與本試驗用體外診斷試劑信息相符，且明確各方的職責分工。根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，本試驗所評價試劑盒屬于二類體外診斷試劑，臨床試驗的總血清樣本數至少200 例，100 例同源血漿樣本，由兩家醫院完成，本機構負責其中的110 例有效血清樣本及58 例有效同源血漿。樣本分組為疾病組[來自系統性紅斑狼瘡、夏普綜合征（MCTD）、干燥綜合征、進行性系統性硬化癥、皮肌炎/多肌炎等患者的樣本]，疾病分類見相關標準[7-10]，其中血清83例、血漿32例，對照組為健康人群，其中血清27名、血漿26名。

1.2 方法 本臨床試驗采用對照試驗和雙盲法設計，將同一樣本用待評價試劑（批號CE161229YA）、對比試劑（1 批號為MB00001，2批號為037532）及第三方試劑（批號E170823AH）進行檢測。將待評價試劑檢測結果與對比試劑及第三方試劑結果進行比較，評價待評價試劑與對比試劑及第三方試劑的符合率和一致性。

該產品用于體外半定量檢測人血清或血漿中抗下述抗原的 IgG 類自身抗體：dsDNA、組蛋白、核糖體 P 蛋白、nRNP、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1和著絲點。試劑盒中每個微孔板條含8個可拆分的包被有上述混合抗原的微孔。第1次溫育時，已稀釋患者樣本在微孔中反應。如果樣本陽性，特異性IgG（也包括IgA 和IgM）與抗原結合；為檢測結合的抗體，加入酶標抗人IgG抗體（酶結合物）進行第2次溫育。然后加入酶底物，發生顏色反應。對比試劑和第三方試劑操作均嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計數資料用例數表示。兩種診斷試驗的一致性用符合率和Kappa值表示。Kappa值＞0.75，為一致性好；Kappa值0.40～0.75，為一致性一般；Kappa值＜0.40，為一致性較差。

2 結果

2.1 待評價試劑與對比試劑檢測結果比較 待評價試劑與對比試劑1 檢測結果陽性符合率為49%，陰性符合率為98%，總符合率為67%，Kappa值為0.40，表明待評價試劑盒與對比試劑盒1 血清檢測結果符合性不佳，見表1。待評價試劑與對比試劑2檢測結果陽性符合率為100%，陰性符合率為70%，總符合率為71%，Kappa值為0.08，表明待評價試劑盒與對比試劑盒2 血清檢測結果符合性不佳，見表2。待評價試劑與對比試劑1 和對比試劑2 檢測結果陽性符合率為49%，陰性符合率為98%，總符合率為67%，Kappa值為0.40，表明待評價試劑盒與對比試劑盒1和對比試劑盒2綜合檢測結果的符合性不佳，見表3。待評價試劑與第三方試劑檢測結果陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，Kappa值為1.00。表明待評價試劑盒與第三方試劑盒檢測血清的檢測結果符合性很好，見表4。待評價試劑與對比試劑和第三方試劑檢測結果陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，Kappa值為1.00，見表5。待評價試劑血清與同源血漿檢測結果陽性符合率為100%，陰性符合率為97%，總符合率為98%，Kappa值為0.96，表明待評價試劑盒血清與同源血漿檢測結果符合性良好，見表6。

表1 待評價試劑與對比試劑1檢測結果比較Table 1 Comparison of test results between reagent to be evaluated and comparison reagent 1

表2 待評價試劑與對比試劑2檢測結果比較Table 2 Comparison of test results between reagent to be evaluated and comparison reagent 2

表3 待評價試劑與對比試劑1和對比試劑2檢測結果比較Table 3 Comparison of the test results of the reagent to be evaluated with the comparison reagent 1 and the comparison reagent 2

表4 待評價試劑與第三方試劑檢測結果比較Table 4 Comparison of test results of reagents to be evaluated and third-party reagents

表5 待評價試劑與對比試劑和第三方試劑檢測結果比較Table 5 Comparison of the test results of the reagent to be evaluated with the comparison reagent and the third-party reagent

表6 待評價試劑血清與同源血漿檢測結果比較Table 6 Comparison of detection results of serum to be evaluated reagent and homologous plasma

2.2 在110 例有效檢測血清樣本中，待評價試劑與對比試劑1和對比試劑2綜合結果間共出現36例不一致結果，經過第三方試劑檢測，待評價試劑與對比試劑/第三方試劑的結果完全相符。綜合所有檢測結果，認為待評價試劑盒與對比試劑/第三方試劑血清檢測結果符合性良好。待評價試劑盒血清與同源血漿不符合的1 份樣本的檢測結果在cutoff 值附近，因此會因為單次檢測的不同而導致結果的偏差，不足以否定待評價試劑對于血清樣本和血漿樣本檢測能力一致的結論。

3 討論

朱華強等[6]研究表明，ANA 陽性見于各類AID 中，即ANA陽性并不僅見于SLE患者血清中，也可在類風濕性關節炎患者和非風濕性疾病患者中發現，如肝病、甲狀腺疾病、傳染病和惡性疾病，在老年人中也可發現[5]。因此，基層的篩查顯得尤為重要。抗核抗體譜檢測試劑大量應用于自身免疫性疾病或健康者或基層醫院的篩查費用較昂貴（尤其使用進口試劑時），因此，推廣國產試劑有利于降低成本費用，這也是本試驗的研究意義。但是由于方法學的局限性，目前間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）仍被認為是測定ANA的金標準技術[11]。

本臨床試驗采用待評價試劑盒與對比試劑/第三方試劑比較的方法評估待評價試劑的性能。通過比較待評價試劑與對比試劑之間的預期用途，發現待評價試劑[抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）]與對比試劑1[抗核抗體篩查試劑盒（酶聯免疫吸附法）]比較，多用于核糖體P 蛋白這一類自身抗體的檢測，因此增加了對比試劑2（抗核糖體P蛋白抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法））與對比試劑1聯合使用作為對比試劑進行性能評估。最終不符合的樣本，采用第三方試劑進行檢測作為最終結果用于分析。同時，本臨床試驗增加了待評價試劑盒與第三方試劑盒的性能對比作為性能評價的補充評價標準。考慮到目前市場上占有率最高的同類產品為EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG生產的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法），本臨床試驗中有必要將待評價試劑的性能與目前最廣泛使用的產品進行性能比較，因此，選擇EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG 生產的產品作為第三方試劑盒，并且選擇采用第三方試劑盒將所有待檢測樣本進行檢測。

本研究結果顯示，終待評價試劑盒與對比試劑/第三方試劑的血清檢測陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，kappa值為1.00。待評價試劑盒檢測血清與同源血漿檢測陽性符合率為100%，陰性符合率為97%，總符合率為98%，kappa 值為0.96。檢測結果可見待評價試劑盒與對比試劑/第三方試劑血清檢測結果符合性良好，且待評價試劑盒檢測血清與同源血漿檢測結果符合性良好。本試驗選擇對比試劑及第三方試劑均為目前國內已上市的同類產品并且均在醫療機構有一定使用，產品性能較受認可。待評價試劑盒與其檢測結果符合性良好說明有一定的推廣價值。本試驗過程中，由申請單位指派的臨床監察員定期對試驗單位進行現場監查訪問，以保證試驗方案的所有內容都得到嚴格遵守和填寫試驗資料的正確。參加試驗人員經過統一培訓，統一記錄方式與判斷標準。整個臨床試驗過程均在嚴格操作下進行。在臨床試驗和數據處理階段均有相應的數據管理措施。參與臨床試驗的單位實驗室建立實驗觀察指標的標準操作規程和質量控制程序保證了本試驗數據真實可靠性。

綜上所述，本試驗中的待評價試劑與對比試劑/第三方試劑的檢測結果有良好的一致性，提示有較好的臨床適用性。