HPLC法測定不同產地天南星中夏佛塔苷及異夏佛塔苷的含量

李 欣 黃旭東 楊成梓，▲

1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122；2.福建省級中藥原料藥質量鑒定技術服務中心，福建福州 350122

天南星為天南星科天南星屬植物，性溫，味苦辛[1]。用于頑痰咳嗽，風癱眩暈等[2]。據報道，天南星中含多類活性物質，包括黃酮苷類[3-5]、多糖[6-7]、氨基酸[8]及毒針晶[9]等其他成分[10-11]。研究表明，天南星富含黃酮類成分，其中夏佛塔苷與異夏佛塔苷兩種黃酮苷的含量相對較高[12]。現代藥理學研究表明，天南星總黃酮提取物具有一定的鎮痛作用[13]，并對腫瘤細胞增殖具有抑制作用[14]。目前有關天南星黃酮類成分的報道主要為總黃酮提取分離及藥理活性研究[3，15-17]，其物質基礎相關研究較少，且不同產地的天南星藥材可能因地域環境、條件的不同而導致其質量上存在差異性，故本實驗采用高效液相色譜法測定天南星中夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量，對比不同產地天南星藥材中兩種成分的含量差異，為其質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜分析儀（日本島津公司），Syncronis aQ C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5μm），HH-2型水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190704），甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號：L1003207913），乙腈（色譜純，默克股份兩合公司，批號JA081230），甲酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F1627027），水為超純水。

1.3 藥材與樣品

天南星（經福建中醫藥大學楊成梓教授鑒定為天南星科植物天南星的正品，樣品烘干，粉碎，過4號篩備用）。夏佛塔苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111912-201703，純度≥93%）；異夏佛塔苷對照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批號：PS0479-0020，純度≥98%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Syncronis aQ C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）乙腈（B）-0.4%甲酸水溶液（D）為流動相（7 ：13 ：80），等度洗脫，流速 0.9 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為 334 nm，進樣量 10 μl。見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品適量，置5 ml量瓶中，加適量甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品溶液母液，加適量甲醇稀釋夏佛塔苷及異夏佛塔苷混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取供試品粉末1 g，量取10 ml 60%乙醇，稱定質量，超聲（功率：600 W，頻率：45 kHz）60 min，放冷，在稱定其質量，用60%乙醇補足減失重量，以4000 r/min離心5 min，過0.45 μm的有機微孔濾膜即得。

圖1 供試品色譜圖（A），對照品色譜圖（B）

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml至 10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 μl，注入高效液相色譜儀，觀察并記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，以混合對照品的濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y夏佛塔苷=24 293X- 14 891（r=0.9999），Y異夏佛塔苷=21 027X- 28 253（r=0.9999），結果說明夏佛塔苷、異夏佛塔苷分別在18.11～108.62 μg/ml，6.14～36.84 μg/ml內線性關系良好。

2.4.2 精密度考察 分別精密吸取同一份混合對照品溶液5次，各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算RSD，得到夏佛塔苷含量RSD值為0.73%及異夏佛塔苷為0.69%，表明精密度良好。

2.4.3 穩定性考察 取同一份混合對照品溶液，分別于 0、4、8、12、24 h 等時間點進樣，精密吸取 10 μl注入高效液相色譜儀，得到夏佛塔苷含量RSD值為1.33%及異夏佛塔苷為0.91%，表明樣品的穩定性良好。

2.4.4 重復性考察 稱取天南星粉末5份，精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，得到夏佛塔苷含量RSD值為2.03%及異夏佛塔苷為1.78%，說明樣品重復性好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取天南星粉末6份（批號為20190507），分別精密加入夏佛塔苷及異夏佛塔苷對照品溶液，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，進樣檢測，結果見表1。

表1 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的回收率

2.5 樣品測定

精密稱取不同產地，不同批次的天南星藥材37批，按照條件2.3項下方法制備天南星供試品溶液，按照條件2.1項下進行含量測定。天南星藥材中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測定結果見表2。不同產地天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量差異較大，夏佛塔苷的含量以四川最高、浙江最低，分別為55.346、0.006 μg/ml，異夏佛塔苷的含量以四川最高、東北最低，分別為 19.068、0.000 μg/ml。

3 討論

3.1 流動相的選擇

針對流動相體系，本實驗分別對乙腈體系和甲醇體系進行考察，發現前期在乙腈體系下，后期在甲醇體系下洗脫，樣品色譜峰分離度高，基線平穩。通過不同濃度的乙酸及甲酸水溶液作為流動相得出0.4%的甲酸水溶液作為流動相時樣品及對照品的色譜峰分離度及保留時間相對較好。

3.2 提取條件的選擇

本實驗分別對提取溶劑、提取方法、提取時間進行了考察，結果表明樣品用60%乙醇超聲（功率：600 W，頻率：45 kHz），提取60 min為最佳條件，其提取率最高。

3.3 色譜柱的選擇

本實驗首次采用Syncronis aQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），進行考察，利用三項流動相進行色譜考察與調整，得出良好的分離結果及保留時間，簡單高速并節省成本。

本研究建立了一種利用HPLC同時測定天南星藥材中夏佛塔苷和異夏佛塔苷的方法，具有快速準確、穩定性高的特點，可快速實現對夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量測定，有利于其質控的進一步研究。其分析結果表明，四川地區的天南星夏佛塔苷、異夏佛塔苷含量最高，在東北、浙江等地區的含量較低，不同產地間的差異性顯著。反映出目前天南星在品種上存在質量參差不齊的問題，僅野生品種可能無法滿足臨床的應用需求，宜在四川、福建等地區有選擇地建立規范化的種植基地，生產出質量穩定的藥材或飲片供臨床藥用，保證臨床用藥的安全性、有效性。

表2 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測定（±s，μg / ml）

表2 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測定（±s，μg / ml）

編號 藥材編號 產地 夏佛塔苷 異夏佛塔苷1 JN01 福建 3.176±0.005 0.433±0.003 2 FZ01 福建 4.969±0.006 0.299±0.006 3 SX01 福建 22.179±0.003 4.389±0.024 4 SX02 福建 19.351±0.005 3.828±0.002 5 SN01 福建 17.157±0.007 7.754±0.012 6 YTO1 福建 4.652±0.011 0.395±0.002 7 GZ01 貴州 25.274±0.012 2.590±0.006 8 GZ02 貴州 23.442±0.015 8.240±0.008 9 SCO2 四川 55.346±0.015 19.068±0.066 10 SC01 四川 54.164±0.001 13.904±0.033 11 HB01 湖北 16.195±0.003 2.537±0.005 12 HN02 湖南 11.288±0.004 1.008±0.002 13 HN01 湖南 10.220±0.003 2.010±0.063 14 AH02 安徽 13.628±0.004 1.661±0.001 15 AH04 安徽 12.574±0.006 2.247±0.003 16 JX01 江西 0.186±0.003 0.000±0.000 17 ZJ01 浙江 0.006±0.005 0.000±0.008 18 ZJ02 浙江 5.483±0.007 0.000±0.000 19 AG03 東北 1.465±0.008 0.000±0.000 20 AG04 東北 2.007±0.002 0.000±0.000 21 JL01 東北 1.421±0.005 0.351±0.005 22 JL02 東北 4.524±0.002 0.546±0.001 23 LN01 東北 0.547±0.001 0.000±0.000 24 YN01 云南 13.903±0.007 4.679±0.043 25 YN02 云南 14.419±0.006 1.354±0.017 26 CD01 四川 49.748±0.007 17.097±0.001 27 PC03 福建 0.208±0.004 0.000±0.000 28 WYS06 福建 9.504±0.014 0.655±0.001 29 PC04 福建 19.635±0.004 7.000±0.008 30 PC06 福建 19.351±0.004 3.828±0.006 31 WYS08 福建 11.286±0.009 10.192±0.006 32 PC08 福建 6.534±0.002 5.284±0.009 33 WYS05 福建 28.913±0.002 10.240±0.001 34 WYS07 福建 23.215±0.014 4.569±0.003 35 PC05 福建 1.730±0.003 4.187±0.004 36 PC07 福建 33.031±0.004 12.254±0.012 37 WYS09 福建 22.815±0.006 5.302±0.001 38 對照藥材 - 1.040±0.005 0.000±0.000