免疫層析技術(shù)及應(yīng)用的研究進展

李雨芮,劉曉雅,張文勁,陳穎鈺，2,郭愛珍，2，胡長敏，2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

膠體金(colloidal gold)作為一種用于免疫學(xué)研究的標(biāo)記物，最早由FAULK等[1]于1971年在試驗中標(biāo)記兔抗沙門菌血清制備得到金標(biāo)抗體，成功地檢測出沙門菌表面抗原而提出。1974年ROMANO標(biāo)記馬抗人IgG的成功使得間接免疫金染色法首次被用于實踐，免疫膠體金技術(shù)開始高速發(fā)展。自20世紀(jì)70年代始，陸續(xù)出現(xiàn)了多種以膠體金技術(shù)為基礎(chǔ)、在光鏡及電鏡水平上與銀顯影和彩色免疫金銀染色相結(jié)合的技術(shù)，使得膠體金免疫診斷有了許多新的應(yīng)用和發(fā)展[2-4]。當(dāng)前，在獸醫(yī)臨床快速診斷中的應(yīng)用較多的主要是膠體金免疫層析法(colloidal gold enhanced immunochromatography assay,GICA)以及快速斑點免疫金滲濾法(dot-immunogold filtration assay,DIGFA)，兩者的區(qū)別主要在于GICA的待測樣品由于毛細(xì)作用在微孔膜上采取平行于膜的方向移動，又稱作側(cè)向?qū)游雒庖邔游龇?lateral flow immunoassay,LFIA)；而DIGFA的待測樣品則是基于滲濾作用在微孔膜上垂直于膜運動，又稱穿流式(flow through)固相膜免疫層析法[5]。免疫膠體金技術(shù)由于成本較低、樣品處理簡單、操作方便易行、反應(yīng)迅速的同時還兼具靈敏方便等優(yōu)點，在生產(chǎn)實際及生活中應(yīng)用廣泛。

隨著各類新技術(shù)的發(fā)展，免疫層析技術(shù)也在不斷更新?lián)Q代，出現(xiàn)了可以一次檢測多個對象及多個檢測線的試紙條；標(biāo)記物的改良使得結(jié)合墊上的標(biāo)記物多種多樣，納米微粒、熒光微球、量子點等標(biāo)記物逐漸被開發(fā)利用；同時，樣品墊上添加的檢測物也不局限于經(jīng)典的血清等體液成分，核酸擴增等反應(yīng)的產(chǎn)物也開始作為試紙條的檢測對象，免疫層析技術(shù)迎來了新的發(fā)展篇章。

1 膠體金免疫層析技術(shù)原理

膠體金是各種還原劑作用于氯金酸(HAuCl4)后生成的一定大小的金顆粒，其在溶劑中表現(xiàn)出穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。堿性環(huán)境中膠體金顆粒(圖1)與表面帶正電的抗原/抗體結(jié)合，所形成的膠體金-蛋白免疫復(fù)合物既具有穩(wěn)定性，還保持了生物活性，可以作為一類示蹤標(biāo)記物在免疫層析中參與反應(yīng)，并顯現(xiàn)肉眼可辨的顏色。研究表明，粒徑在15 nm以上的膠體金在人肉眼觀察結(jié)果時較為理想[6]。

圖1 膠體金膠粒示意圖(Au+.金離子；e-.負(fù)電荷)

向膠體金免疫試紙條上滴加液性樣品后，毛細(xì)作用使金標(biāo)物和樣品中的特異組分一起向試紙條的另一端，即吸水墊方向運動。運動過程中樣品和金標(biāo)物依次與NC膜上的檢測線(test line，TL，T線)、質(zhì)控線(control line，CL，C線)反應(yīng)，表現(xiàn)出顯色或消線的結(jié)果供檢測人員判定(圖2)。整個過程耗時幾分鐘到幾十分鐘不等，結(jié)果簡明易判，這是膠體金免疫層析法在臨床樣品初篩檢測上的一大優(yōu)勢。

圖2 膠體金免疫試紙條結(jié)構(gòu)側(cè)面觀

2 免疫層析技術(shù)研究進展

2.1 膠體金為標(biāo)記物的免疫層析膠體金免疫層析已經(jīng)發(fā)展成為了一種靈敏快速、可行性高且相對其他檢測手段操作更加簡單方便的技術(shù)，極其適用于定性檢測。在人類醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)的臨床檢驗、疾病檢測、食品安全檢測以及其他相關(guān)領(lǐng)域中，膠體金技術(shù)都有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。較為常見的人用產(chǎn)品如人絨毛膜促性腺激素檢測試紙條、人免疫缺陷病毒抗體檢測試紙條、梅毒血清抗體檢測試紙條、瘧原蟲感染檢測試紙條等，不僅節(jié)約了大量的檢查化驗時間，還具有相當(dāng)?shù)目煽啃訹7-9]，適合患者的自檢以及臨床疾病的初篩。

在動物性食品安全檢測方面，GUO等[10]開發(fā)了基于金標(biāo)單抗快速檢測食品中螺旋霉素的試紙條，肉眼即可觀察定性結(jié)果，視覺檢測極限為1.0 μg/L，cut-off值為10 μg/L，可以作為現(xiàn)場篩查牛奶和牛肉樣品中螺旋霉素殘留的有效工具；有研究證明，在檢測克倫特羅殘留的多種方法中，對包括膠體金快速檢測卡、ELISA、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等的檢測效果比較發(fā)現(xiàn)，膠體金快速檢測卡雖然假陽性率較高，但是基本不會漏過陽性樣品，是臨場檢驗的有效初篩手段[11-13]。除了經(jīng)典的T、C雙線模式的試紙條之外，可同時檢測多個對象的試紙條也發(fā)展迅速、廣為流行。吳玉晗等[14]開發(fā)的可以同時檢測牛奶中的四環(huán)素和青霉素的雙重膠體金試紙條檢測限為2 μg/L，方法簡單可靠，且特異性好；同樣，在牛奶中可能存在的過敏原檢測方面，膠體金免疫層析法與常規(guī)蛋白質(zhì)檢測方法靈敏性幾乎相當(dāng)[15]。

在動物疾病的臨床檢測及防控上，近年來膠體金試紙條也有大量的創(chuàng)新和應(yīng)用，為生產(chǎn)管理提供了便利。例如在牛結(jié)核病防制領(lǐng)域，張書環(huán)[16]曾在2007年利用牛分枝桿菌MPB83和MPB70蛋白成功建立了一種牛結(jié)核病膠體金免疫層析方法，填補了當(dāng)時檢測牛結(jié)核病的膠體金試紙條市場的空白；經(jīng)驗證，該方法具有高特異性，而且敏感性顯著高于國外進口試紙條。葉俊等[17]通過制備MPB70+83融合蛋白和單抗，初步建立了一種特異性好、靈敏度高的膠體金免疫層析方法，為篩查感染早期的牛只提供了快速有效的技術(shù)手段。在實驗室診斷方面，STEWART等[18]開發(fā)并在多個實驗室水平評估了一個檢測牛分枝桿菌的新型膠體金免疫層析方法，并證明了此方法具有快速檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)后區(qū)分到種的潛力。在其他動物疾病的檢測方面，李成洪等[19]研制的檢測豬瘟抗體的膠體金檢測卡通過標(biāo)記和包被豬瘟重組E2蛋白，結(jié)合應(yīng)用膠體金定量讀數(shù)儀，對樣本中的豬瘟抗體能做到較精確的定量檢測；趙肖等[20]建立的針對豬肺炎支原體血清和鼻拭子中抗體的膠體金試紙條經(jīng)過試驗評價驗證，與商品化ELISA檢測方法符合率可高達96.1%。

2.2 以新材料為標(biāo)記物的免疫層析雖然目前市場上的主流側(cè)向?qū)游霎a(chǎn)品還是基于膠體金技術(shù)的試紙條，但是隨著材料技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的以各類納米熒光材料為主的新標(biāo)記材料被開發(fā)應(yīng)用于側(cè)向免疫層析，效果卓著。此類材料具有特殊的結(jié)構(gòu)和電磁學(xué)性能，代替膠體金作為顯色劑應(yīng)用于試紙條后，人們可以根據(jù)激發(fā)的熒光波長和強度對微量待測物進行更高精度的定量評價，是一類新興的生物傳感器[21-23]。基于新材料的側(cè)向?qū)游龇椒ㄏ啾扔趥鹘y(tǒng)膠體金方法更能滿足高敏感性、高通量和可量化的現(xiàn)代試紙條體外診斷要求，是技術(shù)層面的一大質(zhì)的飛躍和突破。

2.2.1時間分辨與鑭系元素?zé)晒饷庖邔游?時間分辨熒光免疫熒光法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一類通過標(biāo)記鑭系元素，也稱稀土元素(rare earth elements,REE)，使之與抗原/抗體螯合并被激發(fā)出一定波長熒光，同時對熒光波長和發(fā)光時間兩個參數(shù)進行檢測的新型檢測技術(shù)[24]。由于標(biāo)記物體積小、標(biāo)記物對被標(biāo)記的大分子蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響極低、信噪比高及波峰尖銳等特點，非特異熒光信號對結(jié)果的干擾降低，TRFIA的靈敏度顯著提升[25]。崔乃良等[26]利用TRFIA建立的檢測水產(chǎn)品中氯霉素含量的試紙條，通過測量計算T/C值與國標(biāo)儀器方法檢測結(jié)果高度一致。鑭系熒光免疫方法(LFICA)以TRFIA為基礎(chǔ)，可以對超微量的待測物進行快速檢測，目前已有文獻報道在多種傳染病檢測上的應(yīng)用。吳昊星等[27]開發(fā)了檢測豬瘟的LFICA試紙條，與成品ELISA試劑盒比較的總符合率達97.7%，與熒光抗體中和試驗(fluorescent antibody virus neutralization test,FVNT)的總符合率可達98.5%，其中陰性符合率為100%。此外在豬藍耳病、禽流感、豬圓環(huán)病毒病等多種疾病的防制方面，LFICA試紙條的相繼研發(fā)和評價結(jié)果也提示此類方法具備安全無放射性、兼具快捷與靈敏以及儀器便攜易操作等優(yōu)點，且有良好的應(yīng)用前景[28-30]。

2.2.2熒光微球免疫層析 用于熒光微球免疫測定(fluorescent microsphere immunoassays,FMIA)的微球材料常見的有硅、磁、硒及高分子材料等，直徑在納米級到微米級間，通常采取在其表面標(biāo)記熒光物質(zhì)或在微球內(nèi)置鑭系元素的方法制備得到[31]。相比于最早的熒光素標(biāo)記法，微球可以較好地保護熒光物質(zhì)，增加熒光的穩(wěn)定性；微球體積較小，卻有較好的富集作用，可以降低方法的檢測限。近年也已發(fā)展出了用于免疫層析的新型聚集誘導(dǎo)發(fā)射熒光微球(aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFM)。有報道稱，相比于傳統(tǒng)熒光微球，使用AIEFM可以將分析的靈敏度提高7～11倍[32]。康業(yè)等[33]開發(fā)的檢測犬C-反應(yīng)蛋白的免疫層析方法與進口試劑盒相關(guān)性好，適用于臨床檢測；黃震等[34]利用免疫磁珠富集牛奶中的沙門菌，有效規(guī)避了基質(zhì)干擾，建立了高靈敏度的檢測方法。此外，利用稀土元素制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的各類研究也開始起步，由于其具有反斯托克斯位移特性，洪霞等[35]研究發(fā)現(xiàn)在檢測核酸時，使用上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記是使用有機染料Cy5標(biāo)記效果的4倍，靈敏度的顯著提高提示更大的發(fā)展意義。

2.2.3量子點免疫層析 量子點是一類半導(dǎo)體材料，比表面積大，生物相容性和穩(wěn)定性優(yōu)良。同時，此類材料具有吸收峰寬、激發(fā)光譜連續(xù)分布、熒光強度高和斯托克斯位移大的特點，因此可以實現(xiàn)同一束光激發(fā)下，不同粒徑量子點均可以得到激發(fā)，達到同時多目標(biāo)檢測的效果[36-39]。段宏等[40]開發(fā)的檢測惡性瘧原蟲的免疫層析試紙條使用羧基化量子點，產(chǎn)生了普通量子點2 800倍的熒光強度，單個樣品15 min內(nèi)檢測最低靈敏度可達5.8 Parasite/μL；孫潔等[41]針對H5亞型禽流感病毒，用量子點標(biāo)記特異性單抗，基于夾心法原理制備的檢測H5亞型禽流感病毒的試紙條的標(biāo)準(zhǔn)抗原最低檢測量可達1 μg/L，是市售同類膠體金試紙條靈敏性的100倍，與商品化試劑盒符合率高(99.8%)，特異性好，為H5亞型禽流感病毒的檢測提供了良好基礎(chǔ)；XU等[42]開發(fā)的檢測四環(huán)素的免疫層析方法，被驗證具有出色的抗干擾能力，可以對牛奶、河水樣品進行準(zhǔn)確檢測；蔡甜等[43]開發(fā)的檢測肺炎支原體早期感染產(chǎn)生的IgM抗體的免疫層析方法通過量子點標(biāo)記，對200例臨床樣品進行檢測，符合率可達91.25%，對早期診斷有著重大意義。

2.2.4納米模擬酶免疫層析 納米模擬酶(nanozymes)是近幾十年間成功合成并發(fā)展的一類兼具了納米材料特點與酶的催化功能的模擬酶，與辣根過氧化物酶的催化作用類似，在生物傳感、免疫測定、醫(yī)學(xué)治療及去除污染等許多領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用[44]。常見的材料有Fe3O4、鈀、金、硒等。PARK等[45]開發(fā)的基于熒光富勒烯(fullerene)材料的檢測血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)的免疫層析方法可以在短時間內(nèi)定量地對0.1～10.0 μg/L的CRP進行檢測，對疾病的診斷和預(yù)后評估有重要意義。金納米酶可以通過銅沉積現(xiàn)象放大反應(yīng)信號。田美玲[46]通過試驗驗證，使用金納米酶的試紙條相比于傳統(tǒng)膠體金試紙條的檢測限降低了2～3個數(shù)量級。JINMEI 等[47]開發(fā)了兩步級聯(lián)納米酶免疫層析試紙條檢測牛奶中大腸桿菌O157:H7，放大信號后的試紙條的靈敏度得到顯著提升，檢測限可達1.25×101CFU/mL，是傳統(tǒng)膠體金方法的400倍。

2.3 結(jié)合新技術(shù)的免疫層析免疫層析技術(shù)最初僅能定性地通過TL、CL的顯示情況進行檢測，隨著技術(shù)的發(fā)展和聯(lián)動，除了前文提到過的配置讀卡儀測量灰度進行定性分析的檢測方法外，還有結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、重組聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction,HCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等開發(fā)的免疫層析試紙條也逐漸被發(fā)展起來。此類試紙條不再局限于檢測抗原/抗體等血清學(xué)指標(biāo)，而是可以在核酸層面對樣品進行檢測，因此具有相對傳統(tǒng)膠體金免疫層析法(GICA)來說更高的靈敏性和特異性。

近年來，RPA技術(shù)與LFIA的聯(lián)用頻繁出現(xiàn)。SAFENKOVA等[48]的研究證明，在控制DNA片段長度的前提下，RPA-LFIA可以顯示出更高的靈敏度；ZHAO等[49]首創(chuàng)的檢測牛支原體的RPA-LFIA經(jīng)過驗證，與實時熒光定量方法符合率高，且檢測時間僅需30 min；萬文妍等[50]結(jié)合了RPA技術(shù)與膠體金試紙條，用RPA擴增產(chǎn)物為樣品成功建立了兼具兩種技術(shù)優(yōu)點的快速檢測禽腺病毒血清4型的方法，更加適用于臨場檢測；同樣地，在豬圓環(huán)病毒病防控方面，YANG等[51]開發(fā)的RPA-LFIA方法與實時RPA相比，靈敏度相當(dāng)而檢測時間更短。

在其他技術(shù)方面，陳詩勝等[52]結(jié)合PCR技術(shù)，開發(fā)了檢測無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌4種可致奶牛乳房炎的病原菌的免疫層析方法，通過檢測模擬樣品，顯示試紙條特異性良好且比凝膠電泳更靈敏；宋廣萍[53]利用HCR放大信號，設(shè)計開發(fā)了3種可視化檢測H1N1亞型流感病毒的GICA，其中，利用雙鏈特異性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)結(jié)合HCR，雙重放大信號，建立的檢測方法檢測限可以達到3.12 fmol/L；在食品安全方面，JIANG等[54]開發(fā)的LAMP-LFD，可以同時檢測配方奶粉中3種食源性病原體，且不需特殊技術(shù)預(yù)先富集即可達到靈敏檢測；在瘧疾的體外快速診斷方面，LAMP-LFIA顯示出高靈敏度，檢出限可達0.01 μg/ L，在沒有足夠條件的環(huán)境中，具有巨大的應(yīng)用潛力[55]。同樣的研究也見于JIAO等[56]對檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫層析技術(shù)的開發(fā)，基于多交叉置換擴增技術(shù)(multiple cross displacement amplification,MCDA)與側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)制備相結(jié)合得到了新型方法，即MCDA-LFIA，全過程僅需50 min，檢測限可達10 fg，在靈敏性和特異性評價方面表現(xiàn)優(yōu)秀，簡單的操作和容易達到的反應(yīng)條件對設(shè)備和人員要求較低，適用于結(jié)核病的早期診斷。

3 展望

免疫層析技術(shù)自誕生以來，由于成本較低、樣品處理簡單、操作方便易行和反應(yīng)迅速，同時還兼具靈敏方便等優(yōu)點，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、疾病防控和食品安全檢測等多個方面。在特性上，顯示結(jié)果的指標(biāo)較為單一、不同批次原料可能存在的差異和保存條件等因素固然是膠體金免疫層析技術(shù)的短板，使得單純的膠體金免疫層析技術(shù)受限于自身條件，在高精度的檢驗和定量檢測方面存在一定不足，通常用于初步篩查和定性檢測；但由于其相對簡單的制備過程和操作方法，作為一類快速檢測技術(shù)，相比于其他方法而言膠體金免疫層析具有耗時更短、操作更簡單并具有一定的靈敏性和特異性等不容忽視的優(yōu)點，它在當(dāng)前的快速診斷領(lǐng)域仍是不可替代的[57]。在最近發(fā)生的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)疫情中，截至2020年3月30日，國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)通過的8個新冠病毒抗體檢測產(chǎn)品中膠體金免疫層析方法達5個之多，這是膠體金方法制備簡單、檢測性能良好的體現(xiàn)，對目前新冠疫情的快速體外臨床診斷具有重大意義。

同樣地，近年來的各類新型材料、新型儀器和新興技術(shù)的發(fā)展也給免疫層析技術(shù)和以膠體金為探針的檢測技術(shù)帶來了更多可能。膠體金定量分析儀可以對膠體金試紙條的顯色情況進行比較和評價，它的出現(xiàn)與普及使得普通試紙條的定量或半定量檢測得到突破，手持式的儀器使用便捷、檢測迅速，將簡單的顯色情況轉(zhuǎn)化為具體數(shù)值更便于分析[58]；新的標(biāo)記材料正在逐步取代膠體金顆粒作為標(biāo)記物，使得檢測結(jié)果不僅具有可視性，還具備可量化性，更有利于檢測人員對結(jié)果的量化分析走向精細(xì)化、準(zhǔn)確化；與其他檢測技術(shù)，如PCR等的聯(lián)合應(yīng)用增加了膠體金的檢測靈敏度，檢測對象也不再局限于抗原和抗體，而是可以達到核酸層面，使體外診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確[59]。在國內(nèi)外科研人員的共同努力下，免疫層析技術(shù)的開發(fā)更加全面、應(yīng)用更加廣泛；同時，由于現(xiàn)代互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展和大數(shù)據(jù)的覆蓋，適合臨場初篩檢測的免疫層析試紙條可以提供大量的檢測信息，這類數(shù)據(jù)結(jié)合云端分析的應(yīng)用，可以更好地為醫(yī)療人員因地制宜地選擇治療措施和制定防控方案等提供參考，也有利于進行流行病學(xué)調(diào)查[60-62]。

綜上所述，免疫層析技術(shù)已經(jīng)在向更精細(xì)、更準(zhǔn)確、操作更簡單的方向不斷發(fā)展，傳統(tǒng)原理與各類新型檢測技術(shù)的結(jié)合是新趨勢，也是技術(shù)發(fā)展下的必然結(jié)果。伴隨著新材料、新技術(shù)、新儀器與新觀念的聯(lián)用融合，免疫層析技術(shù)必將進一步完善和發(fā)展，在各類臨床檢測方面將有更廣闊的用武之地。