源于奶牛蹄部感染的牛源污蠅解殼桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

王志浩，郭 龍，劉康軍，李 俊，李建基，崔璐瑩，孟 霞，朱國(guó)強(qiáng)，錢 晨，王 亨

(揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

污蠅解殼桿菌(Wohlfahrtiimonaschitiniclastica)是一種需氧、革蘭陰性短桿菌。于2008年首次在匈牙利布達(dá)佩斯的污蠅第三期幼蟲中分離和鑒定[1]。2012年，中國(guó)首次在上海浦東國(guó)際機(jī)機(jī)場(chǎng)收集的大頭金蠅(Chrysomyiamegacephala)體內(nèi)分離出污蠅解殼桿菌[2]。2016年，山東某奶牛場(chǎng)患有蹄冠炎的奶牛病灶處分離到1株污蠅解殼桿菌[3]。2017年，在吉林省某肉牛場(chǎng)1頭育肥肉牛眼瞼化膿病灶處分離得到了1株污蠅解殼桿菌[4]。2019年，江蘇省某奶牛場(chǎng)多只患有腐蹄病奶牛的膿性分泌物中分離得到同一株菌，命名為JS2019224,通過鑒定，確定為污蠅解殼桿菌，并對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以期為該種細(xì)菌引發(fā)的奶牛蹄病的預(yù)防和治療起一定的指導(dǎo)作用，并對(duì)人畜共患病提出預(yù)警，提高奶牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平。

1 材料與方法

1.1 病料來源江蘇省某奶牛場(chǎng)出現(xiàn)多例蹄部化膿感染性疾病(圖1)，病程2～3周，后肢出現(xiàn)跛行，蹄部紅腫，蹄夾溝出現(xiàn)潰爛、流膿，部分蹄殼脫落。使用雙氧水清洗后用10% 碘伏消毒，病灶處撒高錳酸鉀涂抹松餾油后繃帶纏繞進(jìn)行包扎固定，但治療效果不明顯。

圖1 蹄部感染照片

1.2 主要試劑及儀器胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；Baird-Parker瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；Mueller-Hinton Agar瓊脂購(gòu)自青島科技園海博生物技術(shù)有限公司；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸和基質(zhì)溶液購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；MALDI Biotyper微生物鑒定系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；抗菌藥物藥敏紙片(12種)購(gòu)自杭州微生物生物試劑有限公司；紫外可見分光光度計(jì)SP-2000UV型購(gòu)自上海光譜儀器有限公司。

1.3 細(xì)菌分離及純化用生理鹽水對(duì)感染灶進(jìn)行大量沖洗，無菌采集病灶組織。在超凈臺(tái)內(nèi)無菌操作，將采集的樣品接種于含有5% 綿羊鮮血的瓊脂培養(yǎng)基，于37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落，轉(zhuǎn)培進(jìn)行純培養(yǎng)，后涂片，革蘭染色鏡檢。

1.4 污蠅解殼桿菌的鑒定參考文獻(xiàn)[5]中的方法，挑取單個(gè)菌落，涂抹至MALDI靶板上，同時(shí)在靶板上加1 μL質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品(BTS)，用于質(zhì)量校準(zhǔn)和儀器參數(shù)優(yōu)化，自然干燥。在單菌落涂層上加入1 μL 70% 甲酸水溶液，自然干燥。然后，在單菌落涂層上，加入1 μL基質(zhì)溶液，自然干燥。放入質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜圖，通過特異性的指紋圖譜，與Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，完成微生物的鑒定。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)K-B 法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)污蠅解殼桿菌分離株的藥物敏感性。將保存的凍菌液三區(qū)劃線法接種于5% 鮮血平板培養(yǎng)基上，置于37℃ 培養(yǎng)箱中 18～24 h，挑取單個(gè)菌落加入LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用濁度儀配成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海贛-H瓊脂表面均勻涂布，接種3次，每次平板旋轉(zhuǎn)60 度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，置室溫干燥5 min；將藥敏片貼于瓊脂表面，室溫放置15 min后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16～18 h，測(cè)量藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定按照CLSI 藥敏標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察所分離的污蠅解殼桿菌命名為JS2019224，接種于5% 綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基37℃ 培養(yǎng)24 h呈β溶血(圖2)；呈深灰色，邊緣整齊，圓形隆起的菌落(圖3)。革蘭染色觀察，為革蘭陰性菌，兩端鈍圓，短桿棒狀(圖4)。

2.2 MALDI Biotyper微生物鑒定系統(tǒng)檢查結(jié)果所分離菌株JS2019224的特異性指紋圖譜與Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定為污蠅解殼桿菌，指紋圖譜見圖5。

圖2 溶菌活性呈β溶血

圖3 細(xì)菌培養(yǎng)照片

圖4 革蘭染色鏡檢結(jié)果

2.3 污蠅解殼桿菌藥敏試驗(yàn)見表1。根據(jù) K-B紙片擴(kuò)散法的原理及美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的規(guī)定，使用直尺對(duì)各抗生素產(chǎn)生抑菌環(huán)直徑大小進(jìn)行測(cè)量，判斷其耐藥或敏感。結(jié)果顯示，分離到的污蠅解殼桿菌對(duì)多黏菌素、丁胺卡那、克林霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星5種抗生素敏感。對(duì)阿莫西林鈉-克拉維酸鉀、多西環(huán)素、四環(huán)素、鏈霉素、青霉素、復(fù)方新諾明和頭孢氨芐7種抗生素耐藥。

圖5 污蠅解殼桿菌質(zhì)譜峰圖

3 討論

污蠅解殼桿菌首次報(bào)道于2008年，由TOTH等[1]在污蠅第三期幼蟲體內(nèi)分離得到并鑒定，其為需氧菌，在 pH 5.0～10.5生長(zhǎng)良好，最佳生長(zhǎng)溫度為28～37℃。據(jù)報(bào)道，污蠅解殼桿菌可引起人的敗血癥[6]，敗血癥病例主要來自歐洲和南美洲，患者包括2009年法國(guó)東南部一名60歲的無家可歸女子[7]，2011年美國(guó)南部一名70歲無家可歸男子[8]和英國(guó)一名82歲女子[9]。動(dòng)物感染后發(fā)生敗血癥的病例報(bào)道于2014年美國(guó)密歇根州1只鹿[10]。污蠅解殼桿菌除造成敗血癥外，還可造成其他疾病：2012年，據(jù)報(bào)道，在尼日爾一名患有口面壞疽兒童的皮膚和軟組織中分離到污蠅解殼桿菌[11]；2015年，印度報(bào)道在一例骨髓炎病例中分離得到污蠅解殼桿菌[12]；2015年，美國(guó)報(bào)道在紐約一名26歲男性的腿部感染傷口處分離到污蠅解殼桿菌[13]；2019年，美國(guó)報(bào)道了兩例，一名右腳患有慢性足壞疽的63歲男子和一名左下肢患有蠅蛆病的87歲女子[14]；2019年12月西班牙首次報(bào)道在一例左臂發(fā)生潰瘍的病灶處分離得到污蠅解殼桿菌[15]。所有報(bào)道病例中，最北部地區(qū)是愛沙尼亞，于2015年在一名患有慢性足壞疽的64歲男子的病灶處分離得到污蠅解殼桿菌[16]。

表1 分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

我國(guó)于2012年在上海浦東機(jī)場(chǎng)周圍收集到的污蠅體內(nèi)分離得到污蠅解殼桿菌，通過使用16S rRNA對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定為污蠅解殼桿菌。此后，2016年，于山東某患蹄冠炎的奶牛病灶處分離得到污蠅解殼桿菌；2017年，在吉林患眼瞼炎的肉牛病灶處分離得到污蠅解殼桿菌。本次報(bào)道為2019年3月從江蘇省某患蹄病的奶牛病灶處分離得到1株污蠅解殼桿菌。這表明該人畜共患性病原菌在中國(guó)多個(gè)地方呈零星散發(fā)。由于這種病原菌的主要傳播媒介為蚊蠅等昆蟲，所以做好圈舍的驅(qū)蟲滅蠅及日常的消毒工作是非常重要的。

污蠅解殼桿菌作為一種人畜共患病病原菌，其耐藥性也需要高度重視。2016年報(bào)道的源于山東蹄葉炎的分離株，其藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)所有測(cè)定的抗生素均敏感。2017年吉林分離得到的污蠅解殼桿菌對(duì)紅霉素、青霉素和頭孢拉定3種抗生素耐藥。而本次分離得到的污蠅解殼桿菌對(duì)阿莫西林鈉-克拉維酸鉀、多西環(huán)素、四環(huán)素、鏈霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、頭孢氨芐等7種抗生素耐藥。這表明該細(xì)菌的耐藥性在不同區(qū)域存在差異，同時(shí)其耐藥問題需要高度重視，應(yīng)加強(qiáng)臨床治療抗生素的規(guī)范使用，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。科學(xué)準(zhǔn)確快速地對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定以及藥物敏感性的檢測(cè)，對(duì)細(xì)菌感染類疾病的治療可以起到良好的效果。該研究在進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定時(shí)使用了MALDI Biotyper系統(tǒng)，與普遍應(yīng)用的生化反應(yīng)鑒定以及16S rRNA方法相比，具有更加準(zhǔn)確、快速、方便的特點(diǎn)，對(duì)臨床中發(fā)生的細(xì)菌感染性疾病可以快速鑒定病原菌的種類。

目前報(bào)道的人感染污蠅解殼桿菌大多發(fā)生在環(huán)境惡劣的地方，蠅蛆的大量繁殖會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的傳播。而在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中，不同程度存在蠅蛆的問題，故鑒于此，需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注重環(huán)境衛(wèi)生，提高動(dòng)物機(jī)體自身免疫機(jī)能，合理規(guī)范使用抗生素藥物，減少疾病的發(fā)生，以獲得更高的經(jīng)濟(jì)收益。