馬梨形蟲病在新疆昭蘇地區流行相關因素的調查與分析

宋瑞其，呼爾查，樊新麗，翟雪潔，李 敏，郝蘊偉，巴音查汗*

(1.新疆農業大學 動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農業大學 動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬梨形蟲病是由馬泰勒蟲(Theileriaequi)或駑巴貝斯蟲(Babesiaequi)寄生于馬屬動物(馬、驢、騾和斑馬)紅細胞、淋巴細胞內引起的一種蜱傳原蟲病[1]。主要呈發熱、可視黏膜黃染、下頜淋巴結腫大、流黏液性鼻液和喜臥等癥狀。馬梨形蟲病在歐洲南部、亞洲、俄羅斯、非洲、古巴、中南美洲及美國南部一些地區均有相關報道，其中，在我國新疆大部分地區(如準噶爾盆地、塔里木盆地邊緣區、阿勒泰、塔城、博樂、精河、和靜、烏蘇、烏魯木齊、昌吉、奇臺、且末、若羌、庫爾勒及伊寧市周邊諸縣等[2-8])均有該病的報道。根據國際獸疫局(OIE)(2011年)報告，僅2010年全世界就有27個國家流行馬梨形蟲病的報道[9-10]，據聯合國糧食和農業組織的數據顯示，2013年世界范圍內馬匹存欄量約為1.12億匹，其中全球大約90%的馬屬動物分布在馬梨形蟲病流行地區[11-12]。該病傳播媒介為硬蜱，可傳播該病的有草原革蜱、森林革蜱和邊緣革蜱等 3屬17種蜱蟲[13]。作為蜱傳馬梨形蟲病的疫區，“傳染源(帶蟲馬)—媒介蜱蟲—易感動物(健康馬)”已構成了該病的傳播鏈，無疑是增加了對該病的防控難度，給養馬產業造成了一定的經濟損失且存在巨大的潛在隱患。為保持新疆馬產業健康良好的發展，提高邊遠地區“馬背民族”等農牧民的生活水平，對馬梨形蟲病流行因素的分析研究對該病的防控顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 樣品采集采樣地點為伊犁昭蘇地區。于2016年4月份，隨機采集38只體表蜱蟲(吸血不明顯)及周圍環境中175只游離蜱蟲樣品；于2016年7月份，針對33匹雜交肉馬，分別采集33份全血和19份蜱蟲樣品(1匹馬體表采集的所有蜱蟲算作1份)。

1.2 試劑與主要儀器組織全血DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)公司；膠回收試劑盒購自美國OMEGA 公司；2×Taq PCR Green Mix 購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DL2000 DNA Marker和pEASY-T1克隆載體購自北京全式金生物有限責任公司；體視顯微鏡購自德國Leica公司；RA-DIAL20臺式高速離心機購自西班牙ORTOALRESA公司；ND-2000c型紫外分光光度計購自美國Thermo sciencetific公司;DK-600A型電熱恒溫水浴鍋購自上海一恒科學儀器有限公司；PCR儀購自美國 Bio-Rad 公司；DYY-Ⅲ-5型電泳儀購自北京六一公司。

1.3 蜱蟲的鑒定對2016年4月采集的蜱蟲使用毛筆進行清洗，刷除蜱體表的毛或皮屑等異物，根據盾板形狀將蜱蟲按雌、雄分類，再根據假頭基、須肢、盾板琺瑯彩、氣門板形狀以及足基節等特征對所采集的蜱種進行形態鑒定[14]，并觀察、拍照記錄結果。

1.4 PCR檢測及基因測序

1.4.1引物的設計與合成 根據GenBank中馬泰勒蟲18S基因序列與駑巴貝斯蟲Bc48基因序列設計引物，DNA的提取和基因的PCR擴增，具體見參考文獻[15]。

1.4.2基因測序 用膠回收試劑盒回收純化PCR 產物，連接pEASY-T1 載體上，轉化到 DH5ɑ 大腸桿菌感受態細胞中；將轉化后的菌液涂布在含Kana+( 100 mg/L)的培養基上培養，次日挑取單個菌落，提取質粒，委托上海生物工程技術服務有限公司采用雙向法進行測序。

1.5 數據分析利用公式“感染強度=(攜帶蜱蟲的馬匹數+攜帶梨形蟲的體表蜱蟲數+攜帶梨形蟲的馬匹數)/被調查馬匹數×100%”對馬匹感染寄生蟲強度進行分析；利用NCBI中BLAST 在線軟件對測序后基因序列進行同源性分析；利用SPSS Statistics Version 22.0軟件對數據進行差異顯著性分析；應用Mega 5.0軟件進行系統進化樹分析；使用DNAMAN軟件進行基因序列的同源性比對。

2 結果

2.1 蜱蟲的鑒定經形態學鑒定，分別鑒定出草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.silvarum)和邊緣革蜱(D.marginatus)等3種革蜱。草原革蜱：體卵圓形(5.0 mm×3.0 mm)；盾板前窄后圓，前側與中測琺瑯彩較濃；氣門板逗點狀，背突較直而短；足交粗壯，脛節Ⅳ、前跗節腹面各具有3個細長的齒突；假頭短，假頭基矩形；第Ⅰ基節外距短于或等于內距之長。森林革蜱：體卵圓形[4.5 mm×(2.9 ～3.0) mm]；盾板上琺瑯斑彩明顯；足Ⅰ轉節背距末端尖細；雌蟲足Ⅳ基節外距末端超出該節后緣；雄蟲氣門板背突達到盾板邊緣。邊緣革蜱：體卵圓形(4.8 mm×3.0 mm)；盾板前窄后圓，呈塊狀間隔分布；氣門板大，長逗點形，背突稍彎，伸至盾板邊緣；足交粗壯，Ⅳ股節、脛節、前跗節腹面各具有3個細長的齒突；假頭基矩形，側緣幾乎平行，后端向內微彎；第Ⅰ基節外距明顯短于內距(圖 1)。

2.2 馬體表和牧場的不同種類蜱蟲攜帶馬梨形蟲的分析對2016年4月份采集的馬體表和周圍牧場蜱蟲鑒定出3種硬蜱：草原革蜱、森林革蜱和邊緣革蜱。草原革蜱的優勢度最高，體表和牧場分別占52.6% 和 56.0%；另外，對不同蜱蟲攜帶梨形蟲病原檢測結果顯示，馬駑巴貝斯蟲的感染率相對高于馬泰勒蟲(表 1)。

2.3 不同年齡馬匹感染蜱和梨形蟲的分析對2016年7月份所研究的33匹馬按照不同年齡進行分析，在2～10歲的馬匹中，2歲馬匹的感染強度達到最高(366.7%)，其次為7和10歲馬匹，8歲馬匹感染強度最低(100.0%)；對馬源性、蜱源性梨形蟲的感染率分析，馬自身攜帶馬泰勒蟲病(90.9%)的感染率高于馬駑巴貝斯蟲病(36.4%)，然而，馬體表蜱蟲攜帶梨形蟲病則相反：馬駑巴貝斯蟲病(51.5%)感染率高于馬泰勒蟲病(24.2%)(表 2)。

圖1 昭蘇馬場及其蜱蟲鑒定結果

表1 來自馬體表和牧場的不同種類蜱蟲攜帶馬梨形蟲的分析

表2 不同年齡馬匹感染蜱和其攜帶梨形蟲的分析

2.4 馬匹染蜱率及其攜帶梨形蟲的分析馬匹年齡與攜帶梨形蟲及其媒介蜱之間差異顯著(P<0.05)，馬攜帶蜱蟲數量與馬源性、蜱源性泰勒蟲的感染三者之間均存在顯著差異(P<0.01) (圖 2)。

2.5 帶蟲馬陽性DNA重組質粒的測序及比對分析根據對馬匹、體表蜱蟲和環境游離蜱蟲所攜帶梨形蟲檢測，對所檢測的馬泰勒蟲(Te18S基因)和駑巴貝斯蟲(Bc48基因)陽性樣品進行測序，依據測序結果與國內外其他地區相關基因序列比對，建立系統發育樹進行分析。結果顯示，馬源性和蜱源性的馬泰勒蟲基因差異較大，同源性為98.71%；而不同溯源的駑巴貝斯蟲之間的差異較小，同源性為99.13%(圖 3)。

**P<0.01( Student's t-test)

A.系統進化樹分析;B.DNAMAN比對分析?！?馬泰勒蟲Te 18S基因；●.馬駑巴貝斯蟲Bc48基因

3 討論

當今世界發現的蜱種有870多種，在中國就有110余種，蜱類的地理分布研究，大多是以省為單位進行調查。在青海省有蜱類27種，我國北部山地有9種，柴達木盆地有8種，青南高原有19種[16]；江蘇省有2屬4種[17]；貴州省有2科5屬12種[18]；陜西省有26種。蜱類分布有一定的地理特征[19]，東北三省的蜱類現已知2科7屬21種，其中遼寧省18種，吉林省13種，黑龍江省11種[20]。陳澤等[21]對我國蜱類的地理分布調查結果顯示，中國的蜱類分布特點呈點狀和帶狀分布。新疆、甘肅、西藏、云南、福建、臺灣等省區分布種類最多(30～46種)，而河南、江西等省區分布種類最少(4～6種)，其中新疆共記載2科9屬50余種(亞種)[22]。最常見且對人和家畜危害性最大的是硬蜱科[23]，蜱所寄生的宿主動物泛多，被認為是僅次于蚊媒的病原傳播載體[24]。

硬蜱在吸食宿主血液的過程中不僅會刺激叮咬部位發生炎癥反應，嚴重者亦可引起宿主麻痹性癱瘓，而且它還可以作為許多病原體的傳播媒介，傳播一些常見的原蟲等蜱傳病[25]。蜱及蜱傳病所引起的經濟損失巨大，據聯合國糧農組織(FAO)數據統計顯示，僅硬蜱給畜牧業造成的經濟損失，每年高達70億美元以上[26-27]。

昭蘇縣位于伊犁河谷，雨水充足，有著豐富的草場資源，馬匹數量很多，主要是以放牧形式進行飼養；然而豐富的草場植被資源為大量蜱蟲的孳生提供了有利條件。另外，畜牧業生產使得單位面積內家畜密度升高，直接增加了動物宿主數量和活動強度，從而對蜱產生聚集作用[28]。因此，在放牧形式下馬匹更加有利于被攜帶病原的硬蜱侵襲、叮咬，造成蜱傳馬梨形蟲病流行[29]，并造成一定的經濟損失。馬梨形蟲病主要集中發生于2―6月份和9―11月份兩個時間段[30]。該病的流行與帶蟲媒介硬蜱的孳生和消長等活動規律密切相關，具有一定的地區性和季節性[31]。不同地區感染率的差異可能與環境、蜱種差異性、動物的遷徙及皮革貿易中蜱的傳播作用有關[32]。另外，馬匹攜帶馬梨形蟲病的概率與馬匹的年齡也有一定的關系，幼齡和老齡馬匹由于免疫力低，感染率略高[33-34]。

根據此次在新疆昭蘇地區的調查結果顯示，在所采集的蜱蟲樣品中，有草原革蜱、森林革蜱和邊緣革蜱，其中草原革蜱和森林革蜱數量所占比例較大。同一區域的不同種類蜱的活動季節和活動時間的長短有很大的差別[35]，這可能是造成草原革蜱和森林革蜱在此次采集數量較多，而邊緣革蜱的數量較少的原因。根據馬體表和牧場的不同種類蜱蟲數量及其攜帶梨形蟲病原率分析，蜱蟲數量越多其攜帶馬梨形蟲病的概率就越高。對昭蘇地區不同蜱蟲攜帶梨形蟲病原的檢測結果顯示，馬源性泰勒蟲感染率高于駑巴貝斯蟲，而蜱源性之間的感染率恰好相反(無論是馬體表還是草原游離蜱蟲)，這可能與兩種原蟲的生活史的不同有關[36]。

根據昭蘇的不同年齡段分析馬匹感染強度，其中幼駒的感染強度高于成年馬，幼駒較易感[37]，這可能由于成年馬匹被媒介蜱蟲和或原蟲感染過，促使機體產生了特異性抗體，減少了再次被感染的可能性[38]。經數據統計學分析，馬匹年齡與攜帶梨形蟲及其媒介蜱之間差異顯著(P<0.05)，馬攜帶蜱蟲數量與馬源性、蜱源性泰勒蟲的感染三者之間均存在顯著性差異(P<0.01)。故馬梨形蟲病的流行與馬匹年齡以及馬、硬蜱的帶蟲率均有著密切的關系，進一步驗證了硬蜱的活動，特別是攜帶梨形蟲的硬蜱流行對該病的傳播起著至關重要的作用。

另外，根據馬源性和蜱源性梨形蟲之間系統進化樹分析，馬源性和蜱源性泰勒蟲基因差異較大，同源性為98.71%；而不同溯源的駑巴貝斯蟲之間的差異較小，同源性為99.13%。兩種原蟲在傳播的過程中均存在遺傳變異。昭蘇地區馬梨形蟲病的流行與馬匹年齡、媒介蜱數量、種類及其攜帶梨形蟲率等因素均有關聯性，這為當地進一步了解和防治該病提供理論依據。