水貂阿留申病毒誘導(dǎo)貓腎細(xì)胞(CrFK)凋亡

欒美慧,葛桂陽，宮慶龍,徐 寧,郜艷雪，時 坤,李健明,劉 藝,李東麗，孫志博,冷 雪*,杜 銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林 長春 130118)

水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的一種慢性、進(jìn)行性、病毒性傳染病。AMD最初被認(rèn)為是一種遺傳病，后來證明是由病毒引起的[1]。AMDV分布在世界各地的水貂養(yǎng)殖國家，包括瑞典、丹麥、西班牙、愛爾蘭、荷蘭、俄羅斯、冰島、英國、日本、芬蘭及中國等均有該病流行的報道[2-9]。該病的流行給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[10]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在中國主要的水貂繁殖地區(qū)，AMDV感染率為40%～70%，甚至高達(dá)80%[11]。GONG等[12]抽取1981-2017年AMD相關(guān)的研究，進(jìn)行了系統(tǒng)的回顧和分析，結(jié)果顯示，在此期間中國的AMD總體陽性率為55.3%。目前，已知的AMDV易感動物種類已從水貂擴(kuò)展為灰狐、臭鼬和貉等[13-17]。新發(fā)現(xiàn)的貉藍(lán)狐阿留申病毒(RFAV)、火狐阿留申病毒(RFFAV)和灰狐阿留申病毒(GFAMDV)在2014年被國際病毒分類委員會納入阿留申病毒屬[18]。AMDV可通過血液、唾液、糞便和尿液的直接或間接接觸感染[19-20]。相關(guān)研究人員在貂場養(yǎng)殖工人體內(nèi)檢測到病毒[21]。AMDV對水貂的感染以不同的方式表現(xiàn)，取決于感染宿主基因型、年齡及病毒株的不同，其所表現(xiàn)的臨床癥狀也不同[22]。在成年貂中，AMDV引起漿細(xì)胞增多癥[23-24]。幼貂感染AMDV后，病情表現(xiàn)為急速發(fā)展，出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽等上呼吸道感染癥狀，死亡率較高[25]。

AMDV與其他自主復(fù)制型細(xì)小病毒相比有其特殊的致病機(jī)制。免疫過的成年貂雖然已產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但并不能使其免于AMDV的感染，反而會加快疾病進(jìn)程，即抗體依賴增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement,ADE)。目前研究AMDV疫苗的瓶頸除了復(fù)雜的ADE作用還有尚不清楚的AMDV復(fù)制機(jī)理，有相關(guān)研究表明病毒感染細(xì)胞后，想要在細(xì)胞中完成增殖就必須要參與細(xì)胞本身的調(diào)節(jié)活動，病毒會憑自身的某一些基因阻止細(xì)胞凋亡過程從而使病毒大量復(fù)制或者幫助病毒的持續(xù)感染[26]。因此細(xì)胞凋亡是否在AMDV復(fù)制和持續(xù)性感染中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用十分值得探索。相關(guān)研究顯示AMDV在體外培養(yǎng)時僅可在水貂睪丸細(xì)胞、水貂腎細(xì)胞和貓腎細(xì)胞(CrFK)等中有限地增殖，且不同毒力毒株對細(xì)胞培養(yǎng)條件要求也不同[27-29]。本研究首先通過SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR確定AMDV-G在CrFK細(xì)胞中的有效增殖，然后驗(yàn)證細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)來確定AMDV感染CrFK細(xì)胞后誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，然而細(xì)胞凋亡在AMDV致病過程中是否在發(fā)揮重要作用仍有待于進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料AMDV-G株和CrFK細(xì)胞[29]由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動物疫病實(shí)驗(yàn)室保存；MEM美國Hyclone公司；胰蛋白酶消化液、不含EDTA胰蛋白酶消化液北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；病毒基因組提取試劑盒Omega Bio-Tek公司；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒、Rabbit Anti-Mink IgG/FITC北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒B&D有限公司；Caspase-3活性檢測試劑盒江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)CrFK細(xì)胞用含6%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過程中用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.3 病毒培養(yǎng)及毒價測定待CrFK細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%時，接種AMDV，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每隔15 min晃動1次，然后加入含有2%胎牛血清的MEM細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至3～5 d，在-80℃冰箱反復(fù)凍融2～3次，離心取上清，將上清液置于-80℃中保存?zhèn)溆谩?yīng)用間接免疫熒光法測定已收集的AMDV-G株病毒滴度(TCID50)，用Karber法計(jì)算病毒株TCID50。

1.4 AMDV增殖曲線匯合度達(dá)到70%的6孔板CrFK細(xì)胞，接種AMDV-G株(MOI 為1.0)。感染后2,12,24,36,48,72,96,120 h收集病毒液，每個時間點(diǎn)設(shè)3個重復(fù)，反復(fù)凍融3次，離心取上清液，提取其基因組，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室建立的AMDV SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR來測定不同時間段AMDV-G株的基因組拷貝數(shù)。

1.5 用CCK-8法檢測細(xì)胞活性收集處于對數(shù)生長期的CrFK細(xì)胞用含有6%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度以每孔5104/100 μL置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿70%單層時，每孔分別加入0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 MOI的AMDV-G株病毒液，設(shè)置空白孔調(diào)零，試驗(yàn)重復(fù)3次。感染組及對照組均分別培養(yǎng)2,12,24,36,48,60 h，對應(yīng)時間段的試驗(yàn)孔加入10 μL的CCK-8溶液，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱里孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測定D450 nm值。

1.6 AO/EB熒光染色以1.0 MOI的AMDV-G感染匯合度達(dá)到70%的CrFK細(xì)胞為試驗(yàn)組，同時設(shè)置陰性細(xì)胞對照組。分別在感染后2,12,24,36,48,60 h收集細(xì)胞樣本，用PBS洗滌2次，用500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL AO染色液和5 μL EB染色，輕輕混勻并于4℃避光孵育15 min，用PBS洗滌細(xì)胞1次，利用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取處于對數(shù)生長期的CrFK細(xì)胞用含有6%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待匯合度達(dá)70%后，按MOI=1.0接種AMDV，于37℃溫箱孵育。用不含EDTA的胰蛋白酶消化感染AMDV后2,12,24,36,48,60 h的細(xì)胞和空白對照組細(xì)胞，4℃、1 000 r/min離心5 min，用冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用緩沖液重懸1×106個細(xì)胞，取100 μL緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室溫避光孵育15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 分光光度計(jì)法檢測Caspase-3活性收集對數(shù)生長期CrFK細(xì)胞，接種到6孔板，待細(xì)胞長至70%，用AMDV-G株(MOI=1.0)感染CrFK細(xì)胞為試驗(yàn)組，同時設(shè)立陰性對照組，分別于接毒后的2,12,24,36,48,60 h收集細(xì)胞(3～5)×106個，使用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次；在收集的沉淀細(xì)胞中加入200 μL 4℃預(yù)冷的Lysis Buffer并且緩慢吹打均勻，放置于冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次；4℃、10 000 r/min離心1 min，吸取上清蛋白轉(zhuǎn)移到新的EP管中，使用Bradford法測定蛋白的濃度；吸取50 μL(100 μg)蛋白的細(xì)胞裂解上清(各組均采用同樣的蛋白量進(jìn)行測定和比較)，加入50 μL 的2×Reaction Buffer，5 μL Caspase-3 Substrate在37℃避光條件下孵育4 h；通過測定D405 nm值，根據(jù)誘導(dǎo)劑組D405 nm/陰性對照D405 nm的倍數(shù)來確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0對試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 AMDV-G株培養(yǎng)及毒價測定AMDV-G株接種CrFK細(xì)胞后，應(yīng)用間接免疫熒光試驗(yàn)對接種病毒的細(xì)胞進(jìn)行檢測，可見亮綠色熒光(圖1)，測定收獲病毒液的病毒含量，結(jié)果為106.25TCID50/mL。

A.AMDV-G株感染細(xì)胞；B.陰性對照細(xì)胞

2.2 AMDV-G株增殖曲線使用基于SYBR Green Ⅱ的實(shí)時熒光定量PCR方法獲得病毒生長曲線。感染后48 h，AMDV-G株在CrFK細(xì)胞中大量增殖；感染后120 h，病毒基因組拷貝數(shù)達(dá)最大值為4.41×104拷貝/μL(圖2)。結(jié)果表明，AMDV-G株能夠在CrFK細(xì)胞中穩(wěn)定增殖。

2.3 AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞活性的影響CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，1.0 MOI 及以上病毒滴度的AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞24 h，能顯著抑制CrFK細(xì)胞的生長(P<0.05)，而0.5 MOI的AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞36 h后，才能顯著抑制CrFK細(xì)胞的生長(P<0.05)。結(jié)果表明，AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞具有生長抑制作用，并且感染時間和病毒滴度呈正相關(guān)(圖3)。

2.4 AMDV-G株誘導(dǎo)CrFK細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化AO/EB染色后，利用倒置熒光顯微鏡觀察AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞后2,12,24,36,48,60 h 的感染組和對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞只能被AO染色，2 h感染組和對照組形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常，核染色質(zhì)呈綠色；病毒感染CrFK細(xì)胞12 h后開始出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮的早期凋亡狀態(tài)，而感染24 h不僅出現(xiàn)早期凋亡形態(tài)并且伴隨核固縮和核碎裂的橙紅色熒光晚期凋亡形態(tài)，且隨著時間延長出現(xiàn)更多的晚期凋亡細(xì)胞(圖4)。

圖2 AMDV毒株在CrFK細(xì)胞中的增殖曲線

圖3 AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞活性的影響

圖4 AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)顯示，AMDV-G株感染CrFK后細(xì)胞凋亡率隨著病毒感染時間的延長而呈現(xiàn)升高趨勢，AMDV-G株(MOI為1.0)感染CrFK細(xì)胞12 h時，與對照組差異顯著(P<0.05)，其細(xì)胞凋亡率為9.13%；在60 h時與對照組差異極顯著(P< 0.01)，其細(xì)胞凋亡率均值可達(dá)57.55%(圖5)。

2.6 AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性的影響分別在AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞后2,12,24,36,48,60 h收集細(xì)胞，通過Caspase-3活性檢測試盒檢測其活性變化。數(shù)據(jù)表明，AMDV-G株感染(MOI 為1.0)CrFK細(xì)胞后，Capase-3活性在12 h后發(fā)生了顯著變化(P<0.05)；在感染后60 h時，Caspase-3的活性變化差異極顯著(P<0.01)，與2 h對照組細(xì)胞相比活性增加了3.08倍(圖6)。

3 討論

AMDV強(qiáng)毒株，例如AMDV-Utah、AMDV-K和AMDV-TR株，可以在體內(nèi)傳播，但難以在體外培養(yǎng)和適應(yīng)[30]。AMDV-G是唯一通過AMDV-Utah強(qiáng)毒株的體外細(xì)胞培養(yǎng)獲得的減毒株。據(jù)報道，AMDV-SL3和AMDV-DL125株對水貂有毒力并且可以在體外培養(yǎng)[31-33]。本研究通過先前建立的基于SYBR Green Ⅱ的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了CrFK細(xì)胞中AMDV-G株基因組的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示感染后120 h，AMDV-G株基因組DNA的最大拷貝數(shù)為4.41×104拷貝/μL，說明AMDV-G株可在CrFK細(xì)胞中有效增殖。相關(guān)研究表明，病毒感染細(xì)胞，想要完成復(fù)制就要參與宿主細(xì)胞的相關(guān)調(diào)節(jié)。AMDV-G株增殖的驗(yàn)證為進(jìn)一步研究AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞后，引起了哪些調(diào)節(jié)打下了基礎(chǔ)。

A.流式檢測AMDV-G感染對CrFK細(xì)胞凋亡率的影響；B.流式數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

圖6 AMDV-G株感染對Caspase-3活性的影響

本研究利用CCK-8法檢測AMDV-G株感染對CrFK細(xì)胞活性的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，CrFK細(xì)胞的活性在AMDV-G株感染后可被顯著抑制，且隨著病毒滴度的增大或感染時間的延長，CrFK細(xì)胞存活率降低越顯著。AO/EB染色驗(yàn)證了AMDV感染后CrFK細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面的典型凋亡特征，凋亡早期時，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚和固縮，凋亡中晚期時，細(xì)胞核發(fā)生碎裂，出現(xiàn)凋亡小體具有明顯的凋亡特征。當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的時候，細(xì)胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨(phosphatidylserine，PS)就會外翻到細(xì)胞膜表面，流式細(xì)胞術(shù)可通過熒光探針的Annexin V與外翻的PS結(jié)合來檢測凋亡的細(xì)胞。本研究表明，AMDV-G株感染導(dǎo)致了CrFK細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且具有感染時間的依賴性。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中的重要執(zhí)行分子，它的活化通常被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的重要依據(jù)，AMDV-G株感染細(xì)胞后Caspase-3分子活性隨著時間的延長具有顯著性差異。因此，利用多種檢測方法綜合起來分析，AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞的凋亡率升高和形態(tài)學(xué)變化可進(jìn)一步證明AMDV-G株能夠誘導(dǎo)CrFK細(xì)胞發(fā)生凋亡。

目前，由于AMDV的復(fù)雜致病機(jī)理和ADE作用，并沒有有效的疫苗預(yù)防該病。本研究證明AMDV-G株感染CrFK細(xì)胞后誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生，為進(jìn)一步研究AMDV的致病機(jī)理及疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。