3株鴿源新城疫病毒的分子特征及對鴿的致病性

楊少華，崔 寧，張 琳，黃慶華，黃艷艷，許傳田

(山東省農業科學院 畜牧獸醫研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

鴿新城疫是引起鴿急性、熱性的高度接觸性傳染病之一，對養鴿業的危害巨大，其病原為鴿源新城疫病毒(NDV)，又稱鴿Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-1)[1-4]。在分類上屬于單股負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)[5-6]。NDV屬于單股負鏈、不分節段RNA病毒，基因組長度約為15.2 kb，基因排列方式為 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，分別編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)[7]。NDV只有一個血清型，但基因型較多[1,8]。根據遺傳進化分析可將NDV分為2類，即Ⅰ類(ClassⅠ)和Ⅱ(ClassⅡ)類，Ⅰ類NDV主要從野鳥中分離，多為弱毒株，基因組長度為15 198 nt，Ⅱ類NDV包含強毒和弱毒株，可分為18個基因型(Ⅰ～ⅩⅧ)[9]，Ⅰ～Ⅳ基因型主要為1960年前分離的毒株，基因組長度為15 186 nt，Ⅴ～Ⅷ基因型主要為1960年后分離的毒株，基因組長度為15 192 nt[5,8,10-11]。從鴿中分離的NDV多為ClassⅡ基因Ⅵ型毒株，該基因型又進一步分為Ⅵa～Ⅵi共9個亞型[9,12-14]。Ⅵb、Ⅵf、Ⅵg亞型是我國2000年左右流行的主要基因型，常從鴿、雞或其他家禽分離到[15-16]，近年流行的毒株主要為Ⅵb基因型[17-19]，Ⅵf、Ⅵg型很少分離到[4,20]。

多年來，鴿新城疫一直是危害養鴿業的重要傳染病，發病率為30%～70%，死亡率為40%～80%，有時高達100%[1-4]。為了解山東鴿群NDV的分子流行情況，本研究對2011―2013年從山東分離的3株鴿NDV進行了序列測定和比對分析，并評估了其抗原性和致病性，以期為鴿NDV的防控提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒株與單克隆抗體2011-2013年在新城疫的流行病學調查中從鴿場采集的疑似發病鴿的泄殖腔棉拭子中分離鑒定3株NDV:pigeon/China/SDS/2011、pigeon/china/SD01/13、pigeon/china/SD03/13，分別簡稱為SDS、SD01、SD03，對其進行純化后-20℃保存備用。針對HN的單克隆抗體C3B3、1E5、2F10由我室制備并保存[21]。

1.2 主要試劑反轉錄試劑盒、pEASY-T3 Vector、DNA Marker、瓊脂糖及膠回收試劑盒購自大連寶生物公司；DH5α感受態細胞購自北京全式金生物公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司。

1.3 致病指數檢測利用F蛋白裂解位點的氨基酸序列對3個分離株的致病性進行預測，同時按照OIE推薦的方法對3個分離株在10日齡雞胚的致雞胚平均死亡時間(mean death times,MDT) 和1日齡雛雞的腦內接種指數(intracerebral pathogenicity indexes,ICPI)進行測定。

1.4 與單抗的反應性單抗C3B3 、1E5、2F10以PBS按1∶10 稀釋，然后分別與200 TCID50的SDS、SD01、SD03病毒以等體積混合，37℃作用40 min，接種CEF細胞于37℃培養72 h ，測定細胞培養液的HA效價，以HA ≥2log2判定為陽性反應。

1.5 F和HN基因序列測定和分析TRIzol法從尿囊液中提取病毒RNA，所用引物及RT-PCR方法見文獻[22]。PCR產物純化后連接pEASY-T3 載體，轉化DH5α感受態細胞，鑒定并挑取陽性克隆送公司測序。參照GenBank中發表的鴿NDV代表毒株序列，并根據F基因高變區(47～420 nt)核苷酸序列采用臨位相連法(neighbor-joining)構建系統進化樹。

1.6 分離株SDS的全基因組特征為了更好地了解分離株的遺傳特性，選取毒株SDS，對其進行了全基因組測序并進行了序列分析。測序所用引物及克隆測序方法見文獻[23]，對SDS分段克隆測序，并進行拼接。應用Lasergene v7.1和MAGA 4.1基因分析軟件對拼接的全基因組序列與GenBank中已發表的NDV代表毒株序列進行比對分析，并根據F基因高變區(47～420 nt)構建系統進化發生樹。

1.7 分離株SDS的致病性30只NDV抗體陰性的健康試驗鴿隨機分為3組，每組10只，2個試驗組分別以滴鼻和肌注方式接種0.1 mL 106EID50的病毒，對照組以0.1 mL滅菌生理鹽水滴鼻，3個組分別于3個隔離器內飼養，每天觀察記錄采食、精神和糞便等情況。攻毒后3,5,7,14,21 d分別取喉頭、泄殖腔棉拭子，常規處理后接種10日齡SPF雞胚，檢測其排毒情況；攻毒后7,14 d翅靜脈采血，血凝和血凝抑制試驗(HA-HI)檢測NDV抗體水平；對病死鴿進行解剖，觀察病理變化。

2 結果

2.1 生物學特性血清學試驗顯示，3個分離株與NDV標準陽性血清反應為陽性，與禽流感H5和H9亞型陽性血清反應均為陰性。SDS、SD01 和SD03分離株的MDT分別為89.5,71.2,62.2 h；ICPI分別為1.1,1.2,1.4；根據國際獸疫局(OIE)推薦的毒力判定標準SDS、SD01和SD03分離株均為中等毒力毒株。通過與HN特異性單克隆抗體1E5、C3B3、2F10的反應發現，疫苗株LaSota與3個單克隆抗體均反應，3個分離株僅與C3B3反應，與另外2個單抗1E5、2F10不反應，表明與疫苗株LaSota相比，3個鴿源NDV毒株的抗原性發生了改變(表1)。

2.2 SDS的全基因組序列特性與遺傳進化分析通過測序和拼接，獲得了除5′和3′引物區域外全基因組序列，其GenBank登錄號為JQ993431。SDS基因組全長15 192 nt，基因排列方式為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。與NDV早期基因型(基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)相比，該分離株基因組在NP基因5′非編碼區1 647～1 648 nt處插入6 bp堿基，插入序列為CCCCAA。3′端leader和5′端trailer序列分別為55 nt和114 nt，這與多數NDV毒株相同。NP-P、P-M、M-F、F-HN 和HN-L基因間隔區的序列長度依次為2,1,1,32,48 nt(圖1)。通過全基因組序列同源性分析，SDS與2011年黑龍江分離株Pi/CH/CHLJ/131237(KJ607165)和山東分離株pigeon/China/SDLC/2011(JQ979176)的同源性較高，分別為99.2%和98.8%，與國外毒株PPMV-1/Belgium/98-238/199 (JX9011098)的同源性為95.8%，與經典強毒株F48E8及疫苗株LaSota、V4、Mukteswar的同源性分別為85.4%,83.0%,85.0%,85.7%。

A.基因組簡圖；B.基因起始和基因末端序列；C.基因間隔區序列

2.3 F、HN基因序列與遺傳進化分析3個分離株的F基因全長1 792 bp，編碼553個氨基酸，包含6個潛在的糖基化位點(85NRT87、191NNT193、366NTS368、447NIS449、471NNS473) 和13個保守的半胱氨酸殘基(25,27,76,199,338,347,362,370,394,399,401,424，523)。融合肽(fusion peptide，117～141 aa)存在2處氨基酸替換：V121I和A132S，3個七肽重復區(heptad repeat region，HR)存在2處氨基酸替換，分別為V179I(HRa，143-185aa)和K480R (HRc，471～500 aa)，而主要跨膜區(501～521 aa)相對保守。3個分離株F蛋白裂解位點均為112RRQKRF117，符合NDV強毒的分子特征。將分離株F基因高變區(47～420 bp)序列與41株NDV參考株序列進行遺傳進化分析，結果顯示3個毒株與2011―2017年山東、安徽、上海、廣西、廣東、云南、青海、黑龍江等地的鴿源NDV分離株的遺傳關系較近，屬于同一分支(圖2)，為基因Ⅵb型毒株；2013年的2個分離株SD01和SD03聚于一簇，遺傳距離最近。

HN基因全長2 002 bp，編碼571個氨基酸，含有5個潛在的糖基化位點(119NNS121,341NNT343,433NKT435,481NHT483,508NIS510)和13個半胱氨酸殘基(123,172,186,196,238,247,251,344,455,461,465,531,542)且位置保守。與疫苗株LaSota相比，3個分離株HN蛋白上的5個抗原中和位點(193～201位、345～353位、513～521位、494位及569位氨基酸區域)存在多處氨基酸替換：R197I、N263K、E347G、D349E、R356K、G494D、D569E(表1)，表明3個分離株的抗原性可能發生了一定的變化。

圖2 分離株F基因高變區(47～420 bp)系統進化分析

表1 分離株HN蛋白抗原中和位點及與單克隆抗體的反應性

2.4 致病性試驗結果分別通過滴鼻、肌注的方式用分離株SDS進行攻毒，攻毒后每天觀察鴿的精神、食欲及發病死亡等情況，連續觀察21 d。結果2個攻毒組試驗鴿自攻毒后4 d采食量開始下降，精神沉郁；5 d臨床癥狀明顯，表現為翅膀下垂，流淚，扭頭觀星狀，排黃綠色稀糞，采食量下降。滴鼻組和肌肉注射組的發病率為100%，死亡率分別為60%和70%。病死鴿剖檢，可見腦膜充血，有點狀出血點，腺胃乳頭出血，腺胃肌胃交界處條紋狀出血，腸道出血，肝臟腫大，脾有淤血斑。對照組鴿精神、食欲正常，無臨床癥狀。

滴鼻組在攻毒后5,7,14 d喉頭和泄殖腔有排毒，而肌肉注射組在攻毒后3,5,7,14 d喉頭和泄殖腔均有排毒，排毒高峰在7 d，攻毒后21 d兩個試驗組均檢不出排毒(表2)。分別于攻毒后7，14 d每組隨機取5只鴿采血，測抗體，結果攻毒后7 d 3個組血清NDV抗體均為陰性，14 d時滴鼻組血清抗體為5～7 log2，肌肉注射組為7～8 log2，對照組仍為陰性。

表2 試驗鴿攻毒后不同時間喉頭和泄殖腔排毒情況

3 討論

本研究于2011-2013年從山東發病鴿群分離到3株鴿源NDV(SDS、SD01和SD03)，根據F基因進行系統發育分析鑒定為Ⅵb基因型，與2011年黑龍江分離株Pi/CH/CHLJ/131237有很高的同源性。在過去的20年里，Ⅵb型NDV是世界范圍內流行的主要基因型[1-3]，目前分離到的鴿源NDV多為該型，其他基因型如：Ⅵa、Ⅵd、Ⅵf、Ⅵg較少分離到[4,18]。3株NDV的F蛋白裂解位點氨基酸序列均為112RRQKRF117，具有典型的強毒株特征；MDT分別為89.5,71.2,62.2 h，ICPI分別為1.1,1.2,1.4，比強毒株毒力低；根據OIE推薦的毒力判定標準SDS、SD01和SD03為中等毒力毒株，因此F蛋白裂解位點不是NDV毒力的唯一標準。

與疫苗株LaSota相比，3個分離株在F蛋白的融合肽和七肽重復區存在多處氨基酸替換：V121I、A132S、V179I和K480R，糖基化位點、半胱氨酸殘基、蛋白跨膜區則比較保守；HN蛋白糖基化位點半胱氨酸殘基高度保守，抗原中和表位存在多處氨基酸替換，例如：R197I、N263K、E347G、D349E、R356K、G494D和D569E。單克隆抗體細胞中和試驗發現，與LaSota相比3個分離株與1E5和2F10的反應性發生改變，這可能與HN抗原位點突變有關，疫苗(如LaSota)產生的免疫壓力可能是導致這一突變的主要原因，而抗原位點的突變又將導致疫苗的免疫失敗。

為了了解Ⅵb型NDV對鴿的致病力，選取SDS分離株進行了鴿的攻毒試驗。分別經滴鼻和肌肉注射攻毒鴿，感染后5 d鴿開始發病，癥狀與臨床感染相似，表現為翅膀下垂，流淚、扭頭觀星狀，排黃綠色稀糞，呼吸道癥狀不是很明顯。滴鼻組鴿死亡率為60%，肌肉注射組為70%。而仇旭升等[4]報道用Ⅵb型鴿源NDV分離株ND132和ND167經口、肌肉注射、靜脈注射攻毒鴿，鴿僅表現一過性臨床癥狀，但感染后21 d仍可檢出排毒。表明不同地區的鴿源NDV毒株存在遺傳變異，致病力差異明顯。臨床上有的鴿帶毒不發病，有的發病率和死亡率卻很高，除了氣候、環境、飼養條件和共感染等因素外，分離株的毒力差異也是一個重要原因。

近年來，隨著新城疫的免疫防控措施的加強和養禽規模化集約化程度的提高，新城疫的發病率呈現逐年下降趨勢，當前流行的NDV主要為基因Ⅵ型和Ⅶ型，其中基因Ⅵ型主要存在于鴿群中，基因Ⅶ型主要在雞群和鵝群流行[24]。鴿或雞感染鴿源NDV后均不同程度地通過喉頭和泄殖腔向體外排毒，有的感染后21 d仍能檢出排毒[4,20]，成為新的傳染源。鴿源Ⅵb型NDV曾導致20世紀80年代新城疫的第3次大流行[25-26]，目前鴿源NDV分離株在疫苗免疫壓力下抗原性正在逐漸發生變化，許多分離株與疫苗株LaSota間抗原性存在著顯著性差異[4,18]，這將對NDV防控構成一定的威脅，因此有必要采取一定的措施，加強鴿源NDV的防控。