SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測參與診斷的肺結節1例假陰性分析

周 淼 閆五玲 趙棟梁 劉元元 焦 莉▲

1.河南中醫藥大學第三附屬醫院肺病科，河南鄭州 450008；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，河南鄭州 450008；3.河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南鄭州 450046

肺結節是胸部影像的一種表現，臨床檢出率較高，部分結節可為惡性，是肺癌的早期雛形。肺癌對人類生命健康危害極大，是全球癌癥死亡的首位原因[1-2]，居我國惡性腫瘤死亡和發病的首位[3]，由于難以實現大規模肺癌早期篩查，多數患者在臨床確診時病程已至晚期，喪失了最佳治療機會[4]。因此，世界衛生組織（WHO）提出早診、早治是控制肺癌等癌癥死亡率的有效手段[5]。就肺癌而言，肺結節的及時發現及性質判斷至關重要，然而在臨床工作中并不容易實現。肺結節具有起病隱匿、生長緩慢、缺少癥狀、病灶體積小或密度淡、早期影像特點不突出、生化檢查陰性、活檢不易定位等特點，均給臨床診斷帶來諸多困難及不確定性。目前常用的肺結節診斷手段包括：胸部CT、功能顯像、腫瘤標志物等[6]，但也很難在較短時間內明確結節性質，往往需要對患者進行定期隨訪及動態觀察。隨訪時間可長達5年，患者在隨訪及觀察過程中易產生恐慌情緒或者忽略心態，甚至隨訪中可出現結節突然增大、惡化等后果，故積極探索新的肺結節診斷評估方法勢在必行。近年來，隨著分子遺傳學檢測技術的快速發展，腫瘤生物標志物的基因測試嶄露頭角，對腫瘤的診斷、治療和預后評估有較高靈敏度和特異性[7]，而不同基因組合的甲基化檢測也逐漸應用到肺結節診斷、肺癌早期篩查當中，具有一定的臨床價值[8]。現采用矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）和Ras 相關區域家族1A（Ras association domain family 1 A，RASSF1A）基因組合甲基化檢測參與診斷肺結節一例，報道如下。

1 病例資料

患者栗某，男，57 歲，既往體健，吸煙指數為600，因“左側胸痛6 d”于2019年11月12日就診于河南中醫藥大學第三附屬醫院肺病科，查胸部CT 平掃顯示：左肺門區結節（圖1），考慮腫瘤性病變可能。增強胸部CT 顯示：結節不均勻強化（圖2），腫瘤性病變不排除。

血常規、C 反應蛋白（CRP）、紅細胞沉降率、腫瘤標志物等均正常。2019年11月14日行纖維支氣管鏡檢查，鏡下見左肺上葉尖后段管口輕度外壓性狹窄，管腔黏膜充血水腫，依據胸部CT 及鏡下表現于左肺上葉留取支氣管肺泡灌洗液，于左肺上葉尖后段外支行盲檢及刷檢，所得標本分別送病原學、細胞學、組織學及SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測。

檢查結果顯示：左肺上葉灌洗液涂片未查到抗酸桿菌、真菌，培養48 h 無細菌生長。左肺上葉刷片細胞學發現少量擁擠細胞團，內有異型細胞，不除外腫瘤細胞，由于細胞量少不足以診斷。左肺上葉尖后段外支盲檢病理結果為肺組織慢性炎，偶見極小灶肺泡上皮異型增生，請結合臨床。石蠟切片SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測均為陰性。

為進一步明確診斷，患者轉院至河南省腫瘤醫院，于2019年12月4日在靜吸復合全麻下行胸腔鏡左肺上葉切除及系統淋巴結清掃術，術后病理顯示：（左肺上葉）神經內分泌腫瘤，符合類癌，未累及被膜，腫物大小約2.5 cm×2.5 cm×1 cm，未見肯定的脈管內癌栓及神經侵犯。

圖1 患者胸部CT 平掃結果

圖2 患者胸部增強CT 結果

2 討論

基因甲基化是一種共價化學修飾，雖不造成DNA序列變化，但可使DNA 穩定性、蛋白質與DNA 相互作用方式及染色質結構發生變化[9]。基因甲基化在所有腫瘤中都有發生，已成為腫瘤診斷的可靠靶標[10]，研究發現，在肺癌早期診斷中，SHOX2、RASSF1A 基因具有高度敏感性和特異性[11]，對收集到的肺組織、痰液、支氣管灌洗液、胸腔積液等進行基因甲基化檢測，可發現早期肺癌。SHOX2 基因在多種實體腫瘤中表達異常，如肺癌，乳腺癌和腎癌[10，12-13]，而且它們能較好地對肺部良性疾病和惡性腫瘤進行鑒別診斷[14-15]，甲基化的SHOX2 不僅可作為非小細胞肺癌早期檢測的生物指標，還可作為其預后判斷的獨立預測指標[16]。RASSF1A 基因是一種新型腫瘤抑制基因，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，此基因表達失活主要與啟動子區異常的高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失有關，抑癌基因的過甲基化可為肺癌診斷提供幫助[17]。

本文病例采用SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測對肺結節進行診斷，診斷結果與手術病理檢查結果不一致，為假陰性。分析原因可能如下：

2.1 標本類型選擇不到位

采用基因甲基化檢測的標本來源存在多樣化的特點，如支氣管肺泡灌洗液、活（盲）檢組織、胸腔積液、痰液、血漿等，它們各具優劣勢。以痰液標本為例，長期大量吸煙群體屬肺癌高發群體，并且痰液分泌量較多，無需特殊誘導即可獲得標本，所以痰液標本基因甲基化檢測比較適合長期大量吸煙群體的肺癌初篩。但是痰液檢測同樣存在部分局限性，痰液主要來自于支氣管系統靠近中央的部位，痰液檢測結果難以準確顯示肺外周部位的相關情況，因而對于外周部位肺癌的檢測能力非常有限[18]。分析本文1例患者，雖然胸部CT 提示結節位置靠近肺門，類似中央型病變，但支氣管鏡下見左肺上葉尖后段管口輕度外壓性狹窄，提示病灶位于管腔以外，活檢鉗不能直接到達病灶部位及周圍，通過鉗取組織的方法難以取得滿意標本。若采用支氣管肺泡灌洗液作為標本也許更為合適。支氣管肺泡灌洗液通過先沖刷再回收的方式，能收集較廣泛區域的標本，此種方式不但適合于中央型病變，還可用于周圍型病變的診斷。本文1例患者若采用支氣管肺泡灌洗進行標本取樣，其檢測陽性率可能會有所增加。

2.2 標本量采集不充足

本文1例病例氣管鏡左肺上葉刷片細胞學發現少量擁擠細胞團，內有異型細胞，不排除腫瘤細胞，然而，由于細胞量較少，不足以診斷。活（盲）檢為有創操作，可能造成出血、氣胸等并發癥，盲檢風險更甚，而之后的刷檢也可能加重創面出血，因此，操作者在進行活（盲）檢及刷檢操作時往往由于擔心患者出現并發癥而限制操作次數及深度，繼而導致標本采集量不足。相比之下，支氣管肺泡灌洗液可先后兩次用50 mL 37°C 滅菌生理鹽水沖刷，并進行回收，沖刷范圍深廣，灌洗液回收量充足，極大地提高了診斷陽性率。

2.3 SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化陽性率與肺癌病理類型有關

可做甲基化檢測的基因有多種，不同的基因甲基化陽性率與肺癌病理類型之間存在相關性。Schmidt等[19]通過差異性甲基化雜交技術對肺癌患者支氣管肺泡灌洗液中的癌細胞進行全基因組合分析，發現SHOX2 甲基化對診斷肺鱗癌和肺小細胞癌敏感性較高，分別為82%和97%。有研究顯示[20]，SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測在肺鱗癌和肺小細胞癌中的檢測陽性率分別是90.9%和100%，上述情況可能與這兩種類型的肺癌存在較高水平的SHOX2 基因甲基化有關。本文1例患者的病理檢查結果為類癌，雖然類癌與肺小細胞癌同屬于神經內分泌腫瘤，但兩者之間并不完全相同，不排除存在SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測對類癌陽性率不高的可能性。類癌與肺小細胞癌是否存在基因甲基化位點的不同，尚有待進一步驗證。

2.4 SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化陽性率與肺癌分化程度有關

有研究顯示[12]，支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測對Ⅰ期肺癌的診斷敏感性為75%，而在Ⅳ期肺癌則為100%。這可能與Ⅳ期肺癌惡性程度高、細胞分化程度低、生長速度快、更容易壞死、侵襲性更強，進而導致更多的基因釋放相關。類癌細胞分化程度好，生長較為緩慢，惡性程度較低，因此SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化可能對類癌敏感性不高，從而影響檢測結果的陽性率。

3 小結

分子遺傳學檢測技術的快速發展為腫瘤臨床診斷、治療評估指引了新的方向，其中基因甲基化檢測更是展露鋒芒。臨床上，SHOX2和RASSF1A基因組合的甲基化檢測，對早期肺癌具有敏感性和特異性，可在肺癌的早診早治中得以應用。但同時需關注以下幾點：①需綜合考慮患者情況、病變部位、影像表現等，選擇恰當的標本采集方法，保證標本類型合適，標本量充足，以改善患者檢測結果陽性率。②重視對病理類型和分化程度的提前估測，SHOX2 和RASSF1A基因組合的甲基化檢測可能受病理類型及分化程度的影響較明顯，在檢測前預估有助于保證最終檢測結果的準確性。

本文通過對1例肺結節假陰性案例進行分析報道，總結了其出現的可能原因，以期增強對SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測的認識，從而更好地為肺癌臨床診斷服務。