頭花杜鵑葉中精油成分及其抑菌活性研究

紀若薇，楊 揚，林鵬程

（青海民族大學藥學院/青海省青藏高原植物化學重點實驗室/青海省藥物分析重點實驗室，西寧 810007）

頭花杜鵑（Rhododendron capitatum）系杜鵑花科杜鵑屬植物，是中國西北地區杜鵑屬中分布較廣的一個種，產于青海、甘肅、四川、西藏等地［1］。藏醫常以其花、葉入藥，性溫，味辛，治培根病、肺部疾病等［2］。研究發現頭花杜鵑精油具有明顯的祛痰、鎮咳作用［3］。馬萍等［4］利用GC-MS 對頭花杜鵑精油成分進行了分析，發現主要成分為蒎烯、丁酮、月桂烯、石竹烯等。頭花杜鵑在青海省蘊藏量豐富，為進一步開發利用該資源，對入藥部位葉中精油的抑菌活性和不同季節其精油成分的差異進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

頭花杜鵑于2018 年采于青海省互助北山林場，由青海民族大學藥學院林鵬程教授鑒定。活性測試菌種均購于中國藥品生物制品檢定所，具體見表1。

正構烷烴系列化合物（C7～C30）購自上海安譜科學儀器有限公司；其余試劑均為國產分析純；營養瓊脂購自北京化學試劑公司；蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉購自天津市紅巖化學試劑廠。

Agilent 7890/5975C-GC/MS 氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；AL244 型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HZQ-X100A 型恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；GZX-9076MBE 型數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AS-1060L 型高壓滅菌鍋，鄺杏生物技術有限公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

表1 供試菌種總匯

1.2 方法

1.2.1 精油成分的提取 取新鮮頭花杜鵑的葉粉碎，參照《中華人民共和國藥典》（2015 年版），用水蒸氣蒸餾法提取精油，用1 g 無水硫酸鈉干燥，再取上層清液作為精油供試液。

1.2.2 GC-MS 分析條件

1）色譜條件。色譜柱為HP-5 彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；按設定程序升溫；載氣He；載氣流量2 mL/min；汽化室溫度220 ℃；進樣量0.4 μL；分流比20∶1。用于頂空直接進樣的程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min 升至80 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升至160 ℃，保持 1 min 最后以10 ℃/min 升至290 ℃，保持 6 min。

2）質譜條件。離子源EI；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度200 ℃；數據采集全掃描；質量范圍50～500 amu。

1.2.3 保留指數（KI）測定 精密移取正構烷烴混合對照品，頂空進樣分析，用于計算精油各組分的KI值；分別測定各個條件下正構烷烴的保留時間。根據保留指數公式計算各組分的KI值，KI= 100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)，其中tx、tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數為n和n+1的正烷烴(tn

1.2.4 菌種活化 接種藤黃微球菌、大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌等細菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，30～35 ℃培養18～24 h。接種白色念球菌和黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁培養基上，23～28 ℃培養3～5 d。

1.2.5 菌懸液的制備 將上述細菌培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為108cfu/mL 的菌懸液。將上述真菌培養物加入3～5 mL 含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，孢子洗脫后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用無菌的含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為108cfu/mL 的孢子懸液。

1.2.6 抑菌圈的測定 采用濾紙片瓊脂平板擴散法，對頭花杜鵑葉精油抑菌圈的直徑進行測定。用移液槍從已制備好的待試菌懸液中吸取0.2 mL，加入到200 mL 的營養瓊脂培養基或馬丁氏培養基中，混合均勻。將混合好的帶有菌懸液的培養基依次倒入培養皿中，待培養基凝固。用移液槍分別吸取3、5、7 和 10 μL 精油，噴灑在已滅菌、直徑為 6 mm 的圓形濾紙片上，用已滅菌的鑷子將浸有不同濃度的精油濾紙片貼在同一培養基上。將貼好的培養基倒置在培養箱中，細菌30 ℃培養18～24 h，真菌25 ℃培養24～48 h 后測量抑菌圈的直徑。每個菌種做5 次平行試驗，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 頭花杜鵑葉精油的顏色及出油率

分別提取1、6、10 月采得的頭花杜鵑葉精油，所得提取物均為淡黃色，出油率分別為0.25%、0.32%、0.30%。

2.2 頭花杜鵑葉精油成分分析

對頭花杜鵑葉精油成分進行GC-MS 分析，按峰面積歸一化法計算求得各化學成分的峰面積相對百分含量。通過MSD 化學工作站檢索NIST08 標準質譜圖庫，對照各成分保留指數，結合相關文獻解析［5-11］，確定所測樣品中精油的化學成分（表2）。

從表2 可看出，6 月的精油含量最多，為80.42%，其 次 為 10 月 和 1 月 ，分 別 為 71.11% 和74.17%。1 月份的精油鑒定出化合物最多，達82 種，但各物質的含量相對偏小，含量最高的僅有21.33%。6 月和10 月的精油主成分相似，都以α-蒎烯和β-蒎烯為主，共同物質達17 種。1 月的精油成分與這兩個月份有很大的差異，前者多以脂肪族化合物為主，后者多以萜類化合物為主。表明不同時間采得的頭花杜鵑，其葉精油成分及含量具有很大差異。

表2 頭花杜鵑精油化學成分

續表2

2.3 不同濃度頭花杜鵑葉精油的抑菌活性

通過統計軟件對不同濃度揮發油的抑菌活性進行方差分析，結果P>0.05，表示水平差異不顯著，即同種植物不同濃度的揮發油對同一菌種的抑制作用差異不明顯。可能與試驗中濃度梯度變化較小有關，故研究揮發油對不同菌種的抑菌活性時，選取10 μL 進行比較。

2.4 頭花杜鵑葉精油對不同菌種的抑菌活性

結果表明，頭花杜鵑葉精油對銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大腸埃希氏桿菌沒有抑制作用，對其他5 個菌種都有明顯的抑制作用，其抑菌活性為藤黃微球菌>金黃色葡萄球菌>乙型溶血性鏈球菌>枯草芽孢桿菌>乙型副傷寒沙門菌。

表3 精油對菌種的抑菌活性

3 小結

采集了青海省互助北山不同月份的頭花杜鵑，采用水蒸氣蒸餾法提取葉中精油，采用頂空進樣的方式，利用GC-MS技術分析頭花杜鵑葉精油的成分，結果顯示，頭花杜鵑葉精油的組成隨月份的不同差異較大，其中6 月的精油含量最多，1 月的精油化合物種類最多。

通過濾紙片法對頭花杜鵑葉精油進行抑菌試驗，結果表明，不同濃度的精油對同一菌種的抑制作用不具有顯著性差異，該精油對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、乙型副傷寒沙門菌、乙型溶血性鏈球菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，其中，對藤黃微球菌的抑菌活性最強，該結論或可對頭花杜鵑葉精油的抑菌作用研究提供理論支持。