靜電紡有序rGO／PLCL 支架對hiPSC-CPC 心肌分化影響的初步研究

譚瑤 顏冰倩 艾雪峰 宮藝其 王會景 陳穎 劉明璐 徐徐 王偉 付煒

心血管疾病是目前威脅人類生命健康的主要疾病之一［1］。心肌細胞不具有再生能力，由于各種原因導致的死亡的心肌細胞將由瘢痕組織代替，失去正常的生理功能，最終導致心功能衰竭。對受損的心肌進行細胞治療是目前研究的熱點。

干細胞來源廣泛，避免了利用成熟心肌細胞治療的來源和倫理問題，成為細胞治療的重要來源。人誘導多能干細胞（Human induced pluripotent stem cell，hiPSC）是指將體細胞重編程為多能干細胞，來源廣，可實現個體化治療以避免不良免疫反應［2-3］。目前已經有較為成熟的分化體系，可將iPSC 誘導分化形成心肌細胞［4］。研究發現，在iPSC 心肌分化過程中，細胞轉化為高表達ISL1 的心肌前體細胞（Cardiac precursor cell，CPC）。這些ISL1＋CPC 能產生心臟主要的細胞群，包括心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等，研究認為ISL1＋CPC 更適合作為心臟再生的細胞［5］。然而，目前iPSCs 衍生的心肌細胞較成人心肌細胞仍在形態和功能上具有較大差異［6］。

石墨烯及其衍生物因具有無可比擬的力學特性、優異的導電性，表面積體積比大，能夠進行化學修飾，成為近年來的研究焦點，并被廣泛應用［7］。還原氧化石墨烯（Reduction of graphene oxide，rGO）是氧化石墨烯的還原形式，氧化基團的去除使其導電性優于氧化石墨烯；同時，還原氧化石墨烯擁有良好的生物相容性和低毒性［8］，有利于細胞黏附、增殖和分化［9］，使其成為組織工程一種良好的導電材料；此外，還原氧化石墨烯具有明顯的抗氧化作用［10］，能有效清除心肌損傷產生的活性氧。研究證明，rGO 具有明顯的抗菌作用，有利于減少手術后抗生素的使用［11］。這些良好的特性使其在神經［12-13］、皮膚［14］、骨［15］、肌肉［16］等領域被廣泛應用。在心臟方面，Lee 等［17-18］在新生大鼠心臟注射含有rGO 的混合水凝膠，證明了rGO 作為一種導電材料可以促進心肌細胞成熟。Stone 等［19］的研究證明了含有rGO 的聚酯酰胺能夠促進間充質干細胞向心肌細胞分化。

靜電紡絲技術是利用聚合物溶液或熔體在強電場中噴射紡絲，通過調節紡絲條件，結合不同的材料，制備出不同需求的靜電紡絲支架的一種技術，其制造設備簡單、成本低、可紡材料種類繁多、工藝可控等優點使之成為制備組織工程支架的重要手段之一［20］。特定排列的纖維絲對組織細胞排列具有一定的接觸導向作用［21］。心臟組織中特定的細胞排列方式有利于肌肉收縮以及同步電傳導［22］。研究已證明，靜電紡絲技術獲得的聚丙交酯-共-ε-己內酯（PLCL）具有平行結構的納米纖維，聯合成纖維細胞共培養能夠促進新生大鼠心肌細胞的成熟［23］。

本實驗通過靜電紡絲技術制備含有rGO 的有序PLCL 組織工程支架，對其表面結構、理化性質進行表征，并初步探索其對hiPSC-CPC 增殖、形態以及心肌分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

hiPSC 取自上海兒童醫學中心李彥欣教授課題組，為臍帶血細胞來源hiPSC。臍帶血捐獻者簽署了相關知情同意書。本研究經上海兒童醫學中心倫理委員會審查批準。

相關設備：研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）、泰斯曼高壓電源（大連泰思曼科技有限公司）、掃描電子顯微鏡（泰思肯有限公司）、X 射線衍射儀器（Brukeur 公司，德國）、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）、臺式單軸拉伸試驗機（Instron 公司，美國）、XRD 衍射儀（Bruker 公司，美國）、絕緣導電靜電材料表面電阻測試儀（蘇州精格電子有限公司）、細胞培養箱（Thermo 公司，美國）、激光共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）、流式細胞分析儀（Beckman公司，美國）、酶標儀（Thermo 公司，美國）、實時定量PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。

相關試劑：rGO（昂星新型碳材料常州有限公司）、PLCL（濟南岱罡生物科技有限公司）、六氟異丙醇（百靈威科技有限公司）、TeSR-E8 培養基（Stemcell 公司，加拿大）、EDTA（Thermo 公司，美國）、Y-27632（Stemcell 公司，加拿大）、基質膠（Corning 公司，美國）、PBS 緩沖液體（Hyclone 公司，美國）、Accutase 消化酶（Stemcell 公司，加拿大）、RPMI1640（Thermo 公司，美國）、減胰島素B27添加劑（Thermo 公司，美國）、CHIR99021（Stemcell公司，加拿大）、IWP-2（Stemcell 公司，加拿大）、B27添加劑（Stemcell 公司，加拿大）、心肌細胞消化液（北京賽貝生物技術公司）、Foxp3／轉錄因子染色緩沖液組（Invitrogen 公司，美國）、ISL1 抗體（DSHB 公司，美國）、肌鈣蛋白cTNT 抗體（Proteintech 公司，美國）、α-輔肌動蛋白α-Actinin 抗體（Sigma-Aldrich公司，美國）、TRIZOL（Thermo 公司，美國）、CCK-8 增殖試劑盒（碧云天生物有限公司）、納米分光光度計（Thermo 公司，美國）、QuantiNova ? SYBR ? Green PCR 試劑盒（QIAGEN 公司，德國）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 材料制備與保存

PLCL 支架：PLCL 溶于六氟異丙醇，利用磁力攪拌器攪拌48 h，制備質量體積比為7%的PLCL溶液。

rGO／PLCL 支架：rGO 是經過化學還原的科研級別的化學還原氧化石墨烯。以六氟異丙醇作為溶劑，利用研磨儀60 Hz 分散rGO 制備成rGO 溶液。PLCL 溶于六氟異丙醇，利用磁力攪拌器攪拌48 h后，加入預配的rGO 溶液，配制成混合溶液：rGO／PLCL 質量比為2%，PLCL 溶液質量體積比為7%。

利用自制接收器通過靜電紡絲技術紡制有序靜電紡支架。紡絲電壓為10～11 kV，注射器容積為10 mL，待紡絲溶液5 mL，注射器推進速度為1.5 mL／h，注射器與接收器之間的距離為8.5 cm，圓筒接收器轉速1 000 r／min，接收器表面覆蓋一層200 目的鐵絲網，紡絲濕度維持在30%～40%，溫度維持在25～30 ℃。所制備的材料保存于真空干燥箱中。

1.3 掃描電鏡檢測

將充分干燥的支架材料從真空干燥箱中取出，表面噴金后掃描電鏡觀察支架微觀結構和表面形貌，最后利用Image J 軟件隨機選取200 個數據點統計分析纖維的角度分布，繪制纖維角度分布圖；同時測量支架纖維直徑，并繪制材料直徑分布圖。

1.4 機械性能檢測

將兩組支架材料放入真空干燥箱中1 周，待充分干燥后，切割成30 mm×10 mm 的矩形，支架材料厚度為0.3～0.4 mm，使用臺式單軸拉伸試驗機檢測支架力學性能。將材料固定于儀器上，以10 mm／min的速度記錄下應力-應變曲線，利用應力-應變曲線確定楊氏模量、斷裂點應力和應變極限值。將材料用蒸餾水充分浸泡后重復上述實驗。每組測試3 個樣本。

1.5 成分檢測

通過X 射線衍射儀對材料進行成分檢測。X射線衍射儀裝有0～115 °的CuKα 輻射源（λ ＝1.788 970 nm），用于監測晶體狀態的變化。XRD工作參數：電壓40 kV，電流30 mA，步長0.02 °。

1.6 導電性能檢測

將材料切割成40 mm×40 mm 的矩形，真空干燥后，通過絕緣導電靜電材料表面電阻測試儀采用四探針法測定支架的電阻率，修正系數為23.76。

1.7 hiPSC 培養及鑒定［24］

將融合度達到80%～90% 的 hiPSC 用0.5 mmol／L的EDTA 消化5 min，2 00×g離心5 min后，用含有5 μmol／L Y-27632 的TeSR-E8 培養基按照1 ∶6～1 ∶8重懸并接種到6 孔板中（6 孔板事先用1 ∶70 稀釋的基質膠室溫放置30 min 鋪板），于37 ℃、5% CO2培養箱中維持培養，每天更換TeSRE8 培養基，倒置相差顯微鏡觀察。

將完全貼壁的hiPSC 室溫下以4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加所需的一抗Nanong／Sox2／Oct4／TRA-1-60（1 ∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 hiPSC 心肌分化及鑒定［24］

分化前，將490 mL RPMI1640 和10 mL 減胰島素的B27 補充物（50×）混合，制備分化培養基Ⅰ；將490 mL RPMI1640 和10 mL B27 補充物（50×）混合，制備分化培養基Ⅱ。待6 孔板中hiPSC 融合度達到80%～90%時，用Accutase 消化酶消化，200×g離心后，按12 孔板每孔1×106個hiPSC 重新種植，并在37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養48 h 至細胞鋪滿皿 底，將 TeSR -E8 換 成 添 加 12 μmol／L CHIR99021 的分化培養基Ⅰ，36 h 后，更換為分化培養基Ⅰ，1 d 后更換為含有5 μmol／L IWP-2 的分化培養基Ⅰ，分化第5 天更換為分化培養基Ⅰ。將分化至第6 天的細胞進行心臟前體細胞ISL1 免疫熒光和流式細胞技術鑒定。自第7 天開始，更換為分化培養基Ⅱ，每2 天更換一次新培養基。第10 天以后，可以在平板上觀察到跳動的心肌細胞。

將分化至第6 天的hiPSC-CPC 用Accutase 消化酶消化15 min 后，按1×105個／孔的細胞密度接種于預先鋪好基質膠的24 孔板玻璃爬片上。待貼附完全后，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加心臟前體細胞標志物ISL1 抗體（1 ∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

將分化至第6 天的 hiPSC -CPC 細胞用Accutase 消化酶消化15 min 后，添加 Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min進行固定破膜，添加心臟前體細胞標志物ISL1 抗體冰上孵育30 min，添加相應的熒光二抗（1 ∶1 000）冰上孵育30 min。流式細胞分析儀進行測定分析。

將分化的心肌細胞用心肌細胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細胞消化液Ⅱ消化20 min 后，按1×105個／孔的細胞密度接種于預先鋪好基質膠的24 孔板玻璃爬片上。待貼附完全后，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加心肌細胞標志物cTNT 抗體（1 ∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3遍后，添加相應熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

將分化的心肌細胞用心肌細胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細胞消化液Ⅱ消化20 min 后，添加Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min 進行固定破膜，添加帶有熒光標記的心肌細胞標志物cTNT 抗體冰上孵育30 min。利用流式細胞分析儀進行測定分析。

1.9 rGO／PLCL 有序支架對hiPSC-CPC 分化心肌細胞形態的影響

將支架材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀釋的基質膠中室溫浸泡30 min 鋪膠備用。將分化第6 天的細胞種植在鋪好膠的有序支架上，繼續培養至出現跳動心肌，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，分別添加心肌細胞標志物cTNT、肌動蛋白α-Actin 抗體、4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。用Image J 隨機取500 個統計點統計細胞的排列角度。用Image J 統計3 張不同視野的免疫熒光圖并計算短棒狀細胞占所有心肌細胞的比例。

1.10 rGO／PLCL 有序支架對hiPSC-CPC 分化心肌細胞增殖影響

將材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀釋的基質膠中室溫浸泡30 min 鋪膠備用。將分化第6 天的hiPSC-CPC 種植在鋪好膠的有序支架上，分別在接種后第1、4、7 天利用CCK-8 試劑盒對細胞的增殖情況進行測定。每組3 個重復樣本。

1.11 實時熒光定量PCR 檢測

應用反轉錄聚合酶鏈反應檢測心肌相關基因的表達。收集支架上的分化至第15 天的心肌細胞，加入Trizol 提取總RNA。RNA 的濃度和純度通過納米分光光度計進行驗證。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。采用QuantiNova ?SYBR? Green PCR 試劑盒在實時定量PCR 儀上擴增和檢測。每組3 個樣本，每個樣本3 個重復加樣檢測，收集每個樣本3 個重復的平均循環閾值（Ct）值，以內源性對照18S 標準化檢測結果，依據2-△△Ct計算RNA 相對表達量（表1）。

1.12 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統計分析，數據以ˉx±s表示，組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequences

2 結果

2.1 電紡膜制備及表面形態

在靜電紡絲接收器上覆蓋一層200 目的鐵絲網，將配制的聚合物溶液通過高壓噴射在接收器上形成有序支架。用于靜電紡絲的PLCL 溶液呈均勻無色透明，添加rGO 的溶液呈黑色均質狀。紡制形成的含rGO／PLCL 支架呈灰色，未添加rGO 的PLCL支架呈白色。掃描電鏡下兩組支架材料整體呈現疏松多孔結構，纖維細絲光滑筆直，排列有序，PLCL支架纖維分布在0.6～2.7 μm，80%的纖維分布在1.5～2.1 μm，rGO／PLCL 支架纖維分布在0.3～2.1 μm，80%的纖維分布在0.9～1.5 μm。PLCL 支架和rGO／PLCL 支架纖維角度分布在10 °以內者分別占54%和58%，兩種材料纖維均有90%分布在40 °以內（圖1）。

圖1 電紡膜制備及表面形態Fig.1 Preparation and surface morphology of electrospun scaffolds

2.2 靜電紡絲支架材料鑒定

兩組支架在干燥情況下，根據拉伸試驗數據繪制應力-應變曲線，曲線均近似正比關系，達到最大形變后發生斷裂。楊氏模量分別為（2.82±0.10）MPa 和（0.49±0.03）MPa，差異具有統計學意義（P＜0.000 1）；最大應變分別為280.10%±6.80%和462.70%±46.04%，差異具有統計學意義（P＜0.01）；最大應力分別為（7.89±0.10）MPa 和（2.31±0.01）MPa，差異具有統計學意義（P＜0.000 1）。兩組支架在濕潤情況下，楊氏模量分別為（2.20±0.03）MPa 和（0.63±0.05）MPa，差異具有統計學意義（P＜0.000 1）；最大應變分別為318.70%±17.53%和384.3%±24.34%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；最大應力分別為（6.67±0.15）MPa 和（2.42±0.33）MPa，差異具有統計學意義（P＜0.000 1）。利用XRD 對PLCL 支架、rGO／PLCL 支架、rGO（未進行靜電紡絲）進行成分檢測。PLCL 和rGO／PLCL 支架在16.5 °顯示出PLCL 的特征峰，rGO／PLCL 支架特征峰的峰高度大于PLCL 支架。未進行靜電紡絲的單純rGO 在23 °顯示出rGO 的特征峰。對材料的電阻率進行測定，PLCL 支架電阻率達到400 GΩ，而rGO／PLCL 支架電阻率僅為0.075 GΩ（圖2）。

圖2 PLCL、rGO／PLCL 支架材料鑒定Fig.2 Identification of PLCL scaffolds and rGO／PLCL scaffolds

2.3 hiPSC 鑒定

hiPSC 呈克隆樣生長，細胞排列緊密，邊緣清晰光滑，細胞較小，圓形，核質比高，細胞核顯著。免疫熒光鑒定可以觀察到高表達多能性標志物Oct4、TRA-1-60、Sox2、Nanong（圖3）。

2.4 hiPSC 心肌分化及鑒定

通過添加CH99021 和IWP-2 誘導iPSC 向心肌細胞分化，分化過程中細胞發生形態變化，iPSC逐漸變為松散橢圓形的心肌前體細胞，隨著分化的進行，細胞逐漸變成多形性的心肌細胞形態，在第6天細胞高表達心臟前體細胞標志物ISL1，陽性率為74.7%；并在第10 天開始出現散在自發搏動點并逐漸連成整層細胞片跳動。分化到第30 天，細胞形態清晰，呈多形性，具有明顯的肌節結構，雙核心肌細胞較多，高表達心肌細胞標志物cTNT，陽性率為72.3%（圖4）。

2.5 rGO／PLCL 對hiPSC-CPC 心肌分化的影響

圖3 iPSC 細胞特異性標志物鑒定Fig.3 Pluripotency identification of hiPSC

如圖5 所示，將hiPSC 分化的心臟前體細胞重新接種到PLCL、rGO／PLCL 支架上，繼續培養至第15 天，免疫熒光鑒定結果提示兩組支架材料上的細胞高表達心肌細胞標志物α-Actin、cTNT，細胞排列方向與支架纖維排列方向具有一致性。對細胞長軸與支架纖維長軸形成的夾角進行統計，兩組支架上均有90%以上的細胞在30 °以內，10 °范圍內的細胞分別為69%和68%。心肌細胞能夠被有序支架引導。對分化的短棒狀的心肌細胞進行統計，rGO／PLCL 約有45%的細胞呈現短棒狀形態，顯著高于PLCL 組的20.1%，差異具有統計學意義（P＜0.05），更趨近于成熟細胞棒狀的形態。CCK8 增殖實驗提示PLCL 和rGO／PLCL 支架材料上的CPC 在接種后7 d 內均有增殖能力，分化前期rGO／PLCL 上細胞增殖效率稍高于PLCL 組，后期rGO／PLCL 上細胞增殖效率稍低于PLCL 組，但兩組的增殖差異無統計學意義（P＞0.05）。qPCR 結果提示，rGO／PLC 組中與肌節成熟相關基因CTNT、MYH7／MYH6 的表達高于PLCL 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與細胞間通信相關的連接蛋白CX43 的表達高于PLCL 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 iPSC 細胞心肌分化及鑒定Fig.4 Identification of iPSC cells and myocardial differentiation

2.6 rGO／PLCL 對hiPSC-CPC 心肌分化基因水平上的影響

對CPC 細胞、兩組支架材料上的心肌細胞進行RNA-seq 分析。主成分分析提示，CPC 細胞和支架材料上心肌細胞分群明顯，而PLCL 和rGO／PLCL支架材料上心肌細胞差異較小。差異基因統計分析顯示，CPC 分化至心肌細胞，基因發生顯著變化；PLCL 支架材料與rGO／PLCL 支架材料上的心肌細胞之間差異較小，差異基因主要為下調基因。對這些差異基因進行聚類分析，在細胞成分層面，靶基因主要富集于細胞外空間和細胞外區域等GO 條目中；在分子功能層面，靶基因主要富集于鈣離子結合和細胞外基質組成等GO 條目中；在生物過程層面，靶基因主要富集于細胞黏附和細胞外基質排列等GO 條目中（圖6）。

3 討論

細胞治療為心肌損傷提供了新的治療方案。心臟祖細胞作為種子細胞具有巨大的治療潛力。hiPSC 來源的心臟祖細胞由于來源廣泛，避免了倫理問題，成為了心肌損傷細胞治療的理想種子細胞來源。干細胞分化來源的心肌細胞較成人心肌細胞在形態和功能上仍具有較大差異。目前的許多研究致力于利用模擬天然心臟環境的生物材料使干細胞具有更好的應用潛能［25］。

圖5 有序rGO／PLCL 支架材料對iPSC-CPC 心肌分化的影響Fig.5 Effect of aligned rGO／PLCL scaffolds on differentiation of iPSC-CPC

本實驗利用靜電紡絲技術制備出有序rGO／PLCL 支架，有序的表面結構引導細胞排列，模擬正常心肌組織中心肌細胞的排列方式；工程化支架為貼附其上的心肌細胞提供了更接近于生理組織的機械支撐；導電材料rGO 的添加為種植于其上的細胞提供了更理想的分化環境。

圖6 rGO／PLCL、PLCL 支架上心肌細胞的RNA-seq 分析Fig.6 RNA-seq analysis of cardiomyocytes on RGO／PLCL and PLCL scaffolds

利用靜電紡絲技術紡制出的rGO／PLCL 支架纖維排列具有一致性，種植于其上的hiPSC-CPC 分化形成的心肌細胞在纖維上排列有序，有明顯導向作用。Nunes 等［26］認為有序排列的細胞有利于心肌細胞間電傳導，促進心肌細胞的同步收縮。在材料的紡制中，rGO 的添加使支架纖維直徑顯著降低。Ramazani 等［27］認為這是由于射流中積聚的電荷的強烈排斥作用在rGO 表面產生了大量的負電荷，從而使停留在接收器上的纖維絲具有更小的直徑。以往的研究認為，這種更細的纖維絲基底能夠通過增加孔隙率促進細胞的生長黏附［28］。同時，rGO 的添加增加了支架材料的應變能力，最大可擴增至462%，有利于心肌組織更好的收縮舒張。添加rGO 后，支架的彈性模量下降至（0.49±0.03）MPa（干燥）和（0.63±0.05）MPa（濕潤）。而心肌的剛度在舒張開始時為10～20 kPa，在舒張末期為200～500 kPa［29-30］，剛度在數十千帕到大約1 兆帕的材料是心臟應用的最佳選擇［31］。rGO 的加入使支架接近于正常心肌的力學性能，為心肌分化提供了更接近于生理組織的機械支撐。此外，導電性能測定結果提示，rGO 的添加極大降低了支架的電阻率，為hiPSC-CPC 心肌分化提供了更加良好的電生理環境，為心肌細胞之間同步電傳導和肌肉收縮提供了更有利的環境，有助于心肌分化［19］。通 過 在rGO／PLCL支架上接種hiPSCCPC，發現誘導形成的心肌細胞中有更多的細胞趨近于成熟細胞短棒狀的形態；同時，心肌細胞肌節相關標志物CTNT、MYH7／MYH6 的表達升高提示rGO 的添加有助于肌節的發育；此外，rGO／PLCL 支架上連接蛋白CX43 也呈現更高的表達，CX43 通常在心臟相鄰心肌細胞間盤處觀察到，它們促進電流流動，協調心肌細胞收縮以維持其泵功能［32］，它的升高提示rGO 有助于細胞間的通信和連接。但這些基因在整個RNA-seq 分析中變化差異較小，rGO 的添加僅僅促使小部分基因發生顯著變化。綜上，通過改變電生理環境在一定程度上促進了hiPSC-CPC 細胞分化成熟，如果能結合一定的電刺激，使支架材料提供的電生理環境發揮更顯著的作用，可進一步調節細胞的活動，促進細胞進一步分化成熟。