劉氏正骨方對BMSCs成骨分化中Wnt信號通路及Sclerostin基因的影響?

吳 毛 王建偉 馮 驊 尹 恒 華 臻 俞云飛

（江蘇省無錫市中醫醫院，江蘇 無錫 214000）

骨折是以骨小梁組織連續性破壞為特點，骨組織的修復與重建是在多種組織因子和細胞參與下共同完成。中醫學將其歸屬到“骨折病”范疇，認為骨折必損傷經脈氣血，致血脈離經妄行、血瘀留滯。“劉氏骨傷”作為無錫市非物質文化遺產［1］，經多代傳人總結形成本院經驗方—劉氏正骨方，具有“活血祛瘀，接骨續筋”功效，且臨床療效顯著［2-3］，但有關其促進骨折愈合的具體作用機制尚不明確。近年來有關中藥促進骨折愈合多集中于調節骨代謝、促進成骨細胞形成等方面，其中骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為骨組織干細胞主要來源，可以在BMP、Wnt信號通路等多種生物信息網調節下促成骨分化［4］。現代研究表明［5-6］，Wnt信號通路及其下游靶基因Rnux2、OSX是調節成骨分化的關鍵路徑。硬骨素（Sclerostin/SOST）可以通過抑制Wnt信號通路從而負向調節成骨代謝［7］。我們前期研究發現［8］，通過siRNA抑制Sclerostin基因表達可以促進BMP-4體外誘導BMSCs成骨分化過程。因此，本研究依托無錫市科教強衛項目（ZDRC025），設計實驗探討劉氏正骨方對BMSCs體外成骨分化的影響及其可能作用機制，為劉氏正骨方治療骨折病提供理論基礎，并為其應用于治療骨折提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM（Hyclone，美國）；胎牛血清（GlBICO，美國）；胰蛋白酶（Sigma，美國）；CCK-8試劑盒（Abcam，美國）；茜素紅（Sigma，美國）；總蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司，中國）；一抗：Col1A2、OCN、OPN、Scleros?tin、LRP5、Runx2及GAPDH均為美國Abcam公司產品。二抗：山羊抗兔抗體和馬抗小鼠抗體為美國CST公司產品；NanoDrop 2000（Thermo&Scintific，美國）；細胞計數儀和Trizol（Invitrogen，美國）；實時PCR試劑盒（TOYOBO，中國）；實時PCR儀（RocheLightCycler480，德國）；PCR反應體系和反轉錄試劑盒（Fermentas，美國）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL發光液（上海碧云天公司，中國）。

1.2 含藥血清制備

劉氏正骨方（丸劑）組成：地鱉蟲2 g，血竭1 g，川芎1 g，乳香1 g，沒藥1 g，白術1 g，丁香1 g，杜仲1 g，骨碎補3 g，黨參2 g，當歸3 g，黃芪 1 g，自然銅 1 g，熟地黃3 g，蘇木3 g等。無錫市中醫醫院藥劑室制備，溶解、濃縮為最終質量濃度0.45 g/mL生藥，置于4℃冰箱保存。取與中藥湯劑相同劑量的0.9%氯化鈉溶液配置成對照溶液。中藥血清制備：取體質量100～150 g SD大鼠，依據《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》計算實際大鼠灌藥劑量，終末灌服質量濃度0.45 g/mL。空白血清組給予等量生理鹽水。每天灌藥8∶00、20∶00分別灌服1次，連續7 d，第7天上午8∶00灌注全天量，灌服后1 h后于下腹主動脈采血，經靜置、離心、滅活補體、過濾除菌等步驟制得，分裝并標記含中藥血清和空白血清，放置于-20℃保存備用。

1.3 BMSCs分離與培養

分離：取體質量100～150 g SD大鼠，采取斷頸法處死后消毒、剝離并折斷脛骨及股骨，用含雙抗PBS液（終濃度為青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL）沖洗出骨髓細胞，離心去上清液、PBS重懸，細胞計數。培養：按4×105個/cm2密度將細胞均勻接種于MGM培養基，加入10% FBS、1%雙抗，37℃、5% CO2環境的恒溫箱中培養，3 d換液1次，繼續培養7 d后收集細胞，取部分用于實驗，部分液氮冷藏保存。

1.4 BMSCs成骨分化誘導及分組

將BMSCs按1×105個/cm2密度接種于六孔板，使用MGM培養基培養24 h后進行試驗。依據干預培養條件分為對照組（含10%空白血清）、中藥組（10%中藥血清）、BMP-2組（含BMP-2 50 ng/mL），每2日更換1次培養液，在第28天時收集細胞進行實驗。采用CCK-8檢測細胞活性；采用實時熒光PCR和Western blotting檢測成骨分化相關分子（Col1A2、OCN、OPN）及Scleros?tin基因的mRNA和蛋白水平表達情況；采用ALP和茜素紅染色檢測細胞礦化程度。

1.5 含藥血清對Sclerostin基因濃度依賴性研究

將BMSCs按1×105個/cm2密度接種于六孔板，使用MGM培養基培養24 h后，依據中藥血清濃度分4組：對照組（含10%空白血清）、低濃度組（2.5%中藥血清）、中濃度組（5%中藥血清）、高濃度組（含10%中藥血清），使用空白血清調配使各組最終血清終濃度為10%，每2天更換1次培養液，在第14天時收集細胞進行實驗。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 CCK-8法檢測細胞活性 將BMSCs按1×106個/cm2密度接種于96孔板中，每組設3個復孔，培養24 h后進行干預實驗，干預結束后在避光處加入配置好的CCK-8溶液，37℃孵育2 h，再用酶聯免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值并計算。

1.6.2 DNA含量分析 將BMSCs按3×105個/cm2密度接種于96孔板中，每組設3個復孔，24 h后進行干預實驗，實驗結束后收集細胞樣本。DNA含量由CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒測量；其中，激發波長為450 nm，發射波長為530 nm。

1.6.3 實時熒光PCR法 收集細胞樣品，抽取總RNA，以2 μg反轉20 μL體系進行反轉錄。檢測目的基因的mRNA表達。將反轉的cDNA稀釋5倍，進行實時PCR。擴增體系為10.0 μL，反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 25 s，擴增50個循環。溶解曲線分析：95℃5 s；溶解曲線為單一峰說明是特異性擴增，陰性對照為ddH2O，GAPDH為內參，每個模板做3個復孔，結果使用相對定量2-ΔΔCt方法分析。引物序列詳見表1。

表1 實時聚合酶鏈反應引物序列

1.6.4 Western blotting法 收集細胞樣品，使用蛋白提取緩沖液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF提取蛋白，經冰上靜置、4℃離心后采用BCA法檢測蛋白濃度，SDSPAGE電泳，用0.22 μm孔徑的PVDF膜轉膜，經封閉、一抗孵育、洗滌、孵育二抗后，常規ECL發光液顯色。

1.6.5 ALP染色與茜素紅染色 使用固紫B試劑盒（購自Sigma公司）和茜素紅鈣染色試劑盒（購自Sig?ma公司）分別進行染色，并通過倒置顯微鏡觀察拍照記錄。

1.7 統計學處理

應用PASS Statistics 22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩獨立樣本采用t檢驗，多樣本采用單因素相差分析，方差不齊采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組BMSCs細胞活性及成骨分化的比較

細胞活性實驗：與對照組相比，中藥組和BMP-2組細胞活性明顯增高（P<0.05）；中藥組和BMP-2組中的DNA含量也相應增高。見表2。成骨分化實驗：與對照組相比，中藥組和BMP-2組細胞ALP活性明顯增強（P<0.05），且BMP-2組效果最強（P<0.05）。茜素紅染色結果：中藥組和BMP-2組細胞外礦化程度明顯高于對照組（P<0.05），且BMP-2組效果最強。成骨相關基因Col1A2、OCN和OPN mRNA和蛋白水平表達情況也呈現相同趨勢。相較于對照組和BMP-2組，中藥組中Sclerostin基因表達明顯抑制。見圖1～圖2，表2～表3。

圖1 劉氏正骨方含藥血清上調BMSCs細胞ALP活性及細胞礦化

圖2 各組Col1A2、OCN、OPN蛋白水平表達比較

表2 各組BMSCs細胞增殖和礦化現象比較（±s）

表2 各組BMSCs細胞增殖和礦化現象比較（±s）

注：與本組治療前比較，?P<0.05；與中藥組比較，△P<0.05。下同。

組別對照組中藥組BMP-2組n 3 3 3 CCK-8 0.957±0.062 1.469±0.087*2.043±0.229*△DNA 1.076±0.026 1.311±0.065*2.085±0.211*△

表3 各組BSMC中成骨相關基因與Sclerostin基因mRNA表達比較（±s）

表3 各組BSMC中成骨相關基因與Sclerostin基因mRNA表達比較（±s）

組別對照組中藥組BMP-2組n 3 3 3 ALP活性1.014±0.103 1.723±0.128*3.811±0.262*△茜素紅定量1.047±0.026 1.623±0.244*3.643±0.391*△Col1A2 1.091±0.054 1.526±0.172*3.626±0.366*△OCN 1.083±0.031 1.663±0.219*2.823±0.263*△OPN 1.130±0.064 1.783±0.148*3.533±0.453*△Sclerostin 1.074±0.036 0.911±0.072*4.533±0.725*△

2.2 各組BMSCs活性的比較

見表4。使用不同濃度劉氏正骨方含藥血清處理BMSCs 14 d后發現，與對照組相比，BMSCs細胞活性和DNA含量結果表明低濃度組、中濃度組無明顯差異（P>0.05），但高濃度組細胞活性增強，DNA含量增多（P<0.05）。

表4 各組BMSCs細胞活性及Wnt信號通路相關基因表達（±s）

表4 各組BMSCs細胞活性及Wnt信號通路相關基因表達（±s）

組別對照組低濃度組中濃度組高濃度組n 3 3 3 3 CCK-8 1.045±0.027 1.121±0.060 1.204±0.122 1.551±0.081*DNA 1.034±0.077 1.078±0.071 1.150±0.091 1.457±0.069*LRP5 1.075±0.046 1.170±0.106 1.276±0.093 1.626±0.203*Runx2 1.069±0.034 1.207±0.067 1.449±0.226 2.039±0.084*Sclerostin 1.031±0.115 0.924±0.071 0.827±0.085 0.737±0.049*

2.3 各組Sclerostin、LRP5、Runx2基因表達的比較

見圖3，表4。與對照組相比，高濃度含藥血清可以下調Sclerostin基因表達，上調Wnt信號通路中關鍵分子LRP5蛋白以及下游靶基因成骨關鍵轉錄因子Runx2蛋白的表達，但低濃度和中濃度組無明顯統計學差異（P>0.05）。

圖3 各組Sclerostin、LRP5、Runx2基因蛋白水平的表達

3 討論

“劉氏骨傷”為無錫市非物質文化遺產［1］，由多代傳人總結、完善形成，該方中骨碎補等補腎壯骨，土鱉蟲等活血續筋，熟地黃補血養陰，黨參等補益氣血，血竭等活血散瘀消腫，諸藥合用共奏活血祛瘀、補腎養肝之功效。我們前期臨床研究也表明［4-5］，劉氏正骨方可以有效地促進患者骨折愈合，但其具體作用機制尚不明確。

現代中醫藥促進骨修復與重建的研究多聚焦于骨代謝調節機制等方面。目前研究表明［9］，活血化瘀類中藥可以改善局部微循環、促進骨組織細胞活性與增殖；補腎壯骨類藥可以加快骨代謝、增加骨含量。骨折愈合的關鍵在于骨組織再生與重建，而成骨細胞主要來源于干細胞的定向分化。BMSCs屬于多向分化干細胞，可在特定刺激下發生促成骨分化，該過程是由多種細胞因子和信號通路共同參與調控［10］。BMP-2可以通過Wnt、MAPK等多種信號通路以及Runx2、Osterix等相關轉錄因子促進成骨分化［6］。ALP、細胞礦化現象是評價成骨分化早期和晚期的重要標志；Col1A2、OCN、OPN是成骨源性細胞中反應骨轉化與形成的特異性標志；Sclerostin可負向調控成骨分化［11］。本次研究結果顯示：中藥血清可以增強BMSCs細胞活性與ALP活性，而細胞增殖程度是BMSCs促成骨分化的基礎，而Col1A2、OCN、OPN基因也呈現上調趨勢，提示劉氏正骨方可以促進BMSCs成骨分化，可能是其活血祛瘀、補腎養肝的微觀體現。

Sclerostin早期被作為一種非經典BMP拮抗劑，可與BMP的Ⅰ型和Ⅱ型受體競爭性結合抑制BMP信號通路，從而負調控成骨分化過程［11］。我們前期研究表明［8］，通過siRNA抑制Sclerostin基因表達可以上調BMP-4誘導BMSCs成骨分化。近年來有研究發現［7，13］，補腎強督類中藥復方可以通過體上調Scleros?tin基因表達來抑制BMSCs成骨分化。本次研究結果發現BMP-2可以上調BMSCs中Sclerostin基因表達，這與既往研究結果相一致［12］，但中藥組中Sclerostin基因呈現下調趨勢。近年來研究發現［11，14］，Sclerostin蛋白抑制成骨分化并非主要通過Smad信號通路，而是通過與Wnt/β-catenin信號通路中關鍵受體Lrp5/6中的El螺旋區域競爭性結合，促使GSK-3β對β-catenin的磷酸化，從而抑制Wnt/β-catenin信號激活以及下游轉錄因子Runx2的表達，從而負向調控成骨分化過程，其中Runx2是正向調節BMSCs促成骨分化的關鍵轉錄因子［5］。因此，我們設計實驗進一步探究劉氏正骨方含藥血清促進BMSCs成骨作用與Sclerostin基因之間的關系。實驗結果顯示高濃度劉氏正骨方含藥血清濃度可增強BMSCs細胞活性，這可能與下調Sclerostin基因后抑制成骨細胞程序性凋亡而延長細胞壽命有關［16］。高濃度劉氏正骨方含藥血清可抑制BMSCs中Scleros?tin基因表達，且上調Wnt通路中LRP5和Runx2的表達，提示劉氏正骨方含藥血清可能是通過抑制Scleros?tin基因表達、激活Wnt信號通路途徑，從而促進BSMCs成骨分化過程。

綜上所述，劉氏正骨方含藥血清可以體外促進BMSCs成骨分化，該過程可能與抑制Sclerostin基因表達，激活Wnt信號通路及下游Runx2轉錄因子有關。本研究初采用現代細胞學、分子生物學等技術手段對劉氏骨傷理論中活血祛瘀，接骨續筋理論進行微觀驗證，為中醫藥治療骨折提供新的理論方向與實驗依據。

本實驗不足：由于本次實驗不涉及動物實驗，無法觀察對組織水平的影響；本研究僅探究Wnt通路，還可能有如BMP/Smad信號通路、MSX2轉錄因子等其他因素參與調節，在其他生物信息網絡中的作用還有待進一步探究。