基于網絡藥理學與分子對接技術探究半夏-夏枯草藥對治療高血壓的分子機制?

張澤宇 張 芯

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

近年來，我國高血壓病的患病率不斷上升［1］，2017年美國心臟協會將高血壓的標準調整為≥130/80 mmHg，按此標準，我國成年人高血壓的患病率或將達到46.4%，患病人數可能超過5億人［2］。半夏配伍夏枯草常用于高血壓病、失眠和甲狀腺功能亢進等病癥的治療［3-5］。相關研究表明，半夏具有抗炎和保護血管內皮的作用［6］，夏枯草可通過降低血管緊張素Ⅱ和內皮素-1等含量發揮降壓活性，且作用持久［7］。但中藥多成分多靶點的特點，仍然是系統研究半夏-夏枯草藥對藥效物質和作用機制的一大困難。

網絡藥理學通過構建“藥物-靶點-疾病”的相關網絡，可以分析出中藥的成分與疾病多靶點之間的相互作用，從而在整體上預測其活性成分及作用機制［8］。分子對接技術是通過計算機模擬，預測靶點與藥物分子之間的結合模式與親和力的一種方法［9］。本文將通過網絡藥理學，篩選出半夏-夏枯草藥對的作用靶點，通過聚類分析預測其核心化合物，進而使用分析軟件對靶點進行信號通路分析與分子對接研究，預測治療高血壓的作用機制，為其治療高血壓的臨床和實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 半夏-夏枯草藥對活性成分和作用靶點獲取 利用 TCMSP 數 據 庫（http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“半夏”“夏枯草”作為關鍵詞，設置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，篩選半夏-夏枯草藥對所含化合物成分并獲取其作用靶點。

1.2 半夏-夏枯草藥對高血壓相關靶點的收集 通過 genecards數據庫（https：//www.genecards.org/），以“Hypertension”作為關鍵詞進行檢索，將所得靶點根據Relevance score值降序排列，選取前400個作為疾病靶點。并用Venn工具將其與半夏-夏枯草藥對作用靶點進行交集比對，得到“藥物-疾病”共同作用靶點。

1.3 化合物-靶點網絡的構建 通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-化合物-靶點”網絡，將其作用關系進行網絡拓撲學分析并可視化。以靶點度值（Degree）和中介中心度（betweenness centrality）評價半夏-夏枯草藥對有效成分及靶點的重要程度，從而探究半夏-夏枯草藥對中所含化合物的藥理作用機制。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡的構建 用UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫將“藥物-疾病”共同作用靶點的靶點名稱轉換為基因名稱，并將基因名稱上傳至STRING11.0（https：//string-db.org/），輸出PPI蛋白互作網 絡 圖（protein protein interaction network，PPI net?work），根據分析結果統計靶點蛋白關聯頻次，獲取蛋白互作信息進行研究，篩選出核心靶點。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Bioconductor數據庫（https：//www.bioconductor.org/）對核心靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析并將結果可視化。

1.6 成分-靶點分子對接 將靶點蛋白和化合物分子的pdb文件用AutoDockTools處理后保存為pdbqt格式的文件備用。將處理好的化合物與靶點蛋白，載入AutoDock Vina進行對接，使用Pymol，Ligplus軟件對結果進行分析與可視化。

1.7 “成分-靶點-通路”網絡的構建 取KEGG通路富集分析結果中排名前20的通路，結合文獻，篩選出7條與高血壓相關的通路。將活性成分、靶點、通路導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“成分-靶點-通路”網絡圖。

2 結果

2.1 半夏-夏枯草藥對活性成分的篩選結果 見表1。根據設置的篩選條件，在TCMSP數據庫中篩選出半夏的活性成分11個，夏枯草的活性成分11個。β-谷甾醇，植物甾醇為兩者共同活性成分。

表1 半夏-夏枯草藥對的活性成分

2.2 半夏-夏枯草藥對治療高血壓的靶點預測 利用genecards數據庫對高血壓靶點進行檢索和排序篩選，最終得到400個與高血壓相關的靶點，通過Venny工具與半夏-夏枯草藥對中活性成分作用靶點進行交集比對，得到半夏-夏枯草藥對治療高血壓的“藥物-疾病”共同作用靶點54個，即為半夏-夏枯草藥對治療高血壓的潛在靶點。圖1為“藥物-疾病”的韋恩圖；表2為靶點信息。

表2 半夏-夏枯草藥對治療高血壓的潛在靶點信息表

圖1 半夏-夏枯草藥對靶點與高血壓靶點的韋恩圖

2.3 “藥物-化合物-靶點”相互作用網絡 “藥物-化合物-靶點”網絡總共含有454條邊和211個節點，其中包括2個藥物節點、20個化合物節點（其中β-谷甾醇，植物甾醇為共同活性成分）、189個靶點節點，如圖2所示。

圖2 半夏-夏枯草藥對“藥物-化合物-靶點”網絡

2.4 潛在靶點蛋白相互作用網絡分析 基于蛋白與蛋白之間相互作用關系，利用STRING數據庫構建半夏-夏枯草藥對潛在靶點蛋白的PPI網絡圖（見圖3）。得到的PPI網絡包含54個節點，741條邊，平均Degree為27.4。根據節點的Degree值大小繪制出30個關鍵靶點蛋白節點的條形圖（見圖4）。其中白細胞介素-6（IL-6）、蘇氨酸蛋白激酶（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）的度值（Degree=48/45/44）較其他靶點蛋白高，說明這3個靶點在網絡中發揮了關鍵的作用，是連通網絡中其他靶點蛋白的橋梁。

圖3 半夏-夏枯草藥對潛在蛋白靶點的相互作用網絡

圖4 半夏-夏枯草藥對治療高血壓的STRING網絡關鍵靶點（排名前30）

2.5 分子對接結果與分析 利用AutoDock Vina軟件，對靶點相互作用網絡中degree值最大的3個靶點蛋白（IL-6、Akt1、TNF）與半夏-夏枯草藥對中的4個相關活性成分進行分子對接，對接結果見表4，最低結合能表示化合物與靶點蛋白具的結合能力，結合能越小，代表兩者結合的越好［10］。圖5表示3個靶點蛋白與其各自對應活性化合物對接最好的組合，其中包括IL-6與 luteolin，Akt1與 luteolin，TNF與 quercetin。對接結果說明了半夏-夏枯草藥對中活性成分和靶點蛋白之間具有良好的結合能力。

表3 靶點蛋白與活性化合物的對接結果

圖5 IL-6與luteolin，Akt1與luteolin，TNF與quercetin的結合模式

2.6 KEGG通路富集結果與分析 利用Bioconductor數據庫對“藥物-疾病”共同作用靶點進行KEGG通路富集分析并將分析結果轉化為氣泡圖。KEGG通路富集分析（圖6）提示，糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物-糖基化終產物受體信號通路（AGE-RAGE signal?ing pathway in diabetic complications），流體剪切力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway），白細胞介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等信號通路與高血壓的聯系更為密切。

圖6 半夏-夏枯草藥對潛在靶點的KEGG通路富集分析

2.7 “成分-靶點-通路”網絡的構建與分析 將半夏-夏枯草藥對治療高血壓的活性成分，靶點蛋白，分析篩選出的相關信號通路導入Cytoscape3.7.2軟件，構建“成分-靶點-通路”網絡圖，將3者的關系可視化（見圖7）。圖中共有51個節點，149條邊。“成分-靶點-通路”網絡圖體現了中藥治療疾病，具有多成分、多靶點、多通路的特點，作用機制復雜。

圖7 半夏-夏枯草藥對“藥物-成分-靶點-通路”網絡

3 討論

中醫學將高血壓歸于“眩暈”的范疇。朱丹溪在歷代醫家認識的基礎上提出“無痰不作眩”的病機理念，指出“眩暈屬痰者居多，蓋無痰不能作眩也”［11］。高血壓的證候研究結果顯示其證候以肝陽上亢為主，兼夾痰濁、痰熱、血瘀等［12］。半夏化痰散結，夏枯草清熱瀉火、化痰散結，兩藥配伍共奏清熱、化痰、散結之功效，與高血壓的主要證候良好契合。

本研究搜集了半夏-夏枯草藥對治療高血壓的活性成分共計20個，其中槲皮素、山柰酚等具有治療高血壓的相關作用。根據文獻記載，槲皮素能夠抑制血管緊張素轉換酶的活性，改善內皮血管舒張［13］，山柰酚可以增強血管內皮的非依賴性和依賴性舒張［14］。

PPI網絡顯示，半夏-夏枯草藥對的活性成分主要通過作用于IL-6、Akt1、TNF 3個靶點發揮治療高血壓的作用。靶點蛋白IL-6在血管內的炎癥反應與免疫反應中起著關鍵的介導作用，能促進血管平滑肌細胞DNA的合成及增殖，與原發性高血壓有著密切的關系［15］。在特發性肺動脈高壓中，Akt1信號聯級參與遠端肺動脈平滑肌細胞的增殖與遷移增強，具有無效Akt1編碼基因的小鼠患有肺動脈高壓的概率很低，Akt1活性強弱影響著特發性肺動脈高壓的發病［16］。在原發性高血壓的發病機制中，TNF-α通過細胞毒作用，導致血管內皮功能障礙，TNF-α影響著機體對血壓的控制［15-17］。分子對接結果顯示，半夏-夏枯草藥對的活性成分與IL-6、Akt1、TNF有很好的親和力，半夏-夏枯草藥對所含化合物治療高血壓的生物活性需要進一步實驗驗證。

通過分析預測出的靶點和通路發現半夏-夏枯草藥對治療高血壓，主要是通過影響晚期糖基化終產物-糖基化終產物受體（AGEs、RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等發揮作用。AGE與RAGE的相互作用，可能通過影響血管平滑肌細胞的增殖誘導血管肥厚，進而導致肺動脈高壓的發生［18］。文獻記載，較高的血流剪切力利于維持正常的血管內皮功能，減少內皮損傷因子分泌，保護血管內膜，有效防止高血壓的發生［19］。腫瘤壞死因子可引起血管內皮損傷、促進血管平滑肌細胞的增殖、誘導IL-6的表達和釋放，在高血壓的發生發展中扮演重要角色［20］。有研究證明，IL-17的過表達將誘導全身內皮功能障礙與動脈高壓［21］。

本研究利用網絡藥理學和分子對接方法，預測分析半夏-夏枯草藥對的活性化合物、抗高血壓的分子機制并發掘了潛在的治療靶點，以期為下一步實驗研究提供參考。