原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)水平分析

陳 哲 張 靈 劉 潔 張 斌 高炳華

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北張家口 075000

原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocy topenia，ITP）既往又稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種常見(jiàn)的出血性疾病，臨床以皮膚黏膜出血為主，嚴(yán)重者可有內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血，患者可有明顯乏力癥狀[1]。體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板過(guò)度破壞以及巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常導(dǎo)致血小板生成不足是ITP 疾病發(fā)生的重要機(jī)制[2]。有研究證實(shí)，細(xì)胞免疫紊亂在ITP 發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，其中以自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞活化最為關(guān)鍵[3-6]。T 細(xì)胞活化過(guò)程除受第一信號(hào)、協(xié)同刺激型號(hào)等調(diào)控外，還受到負(fù)性信號(hào)分子反饋調(diào)控。程序性死亡因子-1（PD-1）/PD-L1 屬于B7/CD28 家族的一對(duì)負(fù)性共刺激分子，在T 細(xì)胞活化及免疫耐受中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[7-10]。基于此，本研究通過(guò)檢測(cè)ITP 患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)，探討PD-1 在ITP 發(fā)病中的作用，從而為ITP 的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）血液科2015 年12 月—2017 年12 月收治的100 例新診斷的ITP 患者納入研究組，男36 例，女64 例；年齡23～68 歲，平均（42.59±6.35）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016 年版）》[11]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書，配合治療和隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有假性血小板減少、繼發(fā)性血小板減少或先天性血小板減少癥；②妊娠或哺乳期婦女；③合并造血系統(tǒng)疾病；④參與本次研究前30 d 內(nèi)接受過(guò)血小板輸注、糖皮質(zhì)激素和丙種球蛋白治療。

同期選取我院門診體檢的健康志愿者50 名作為對(duì)照組，男18 名、女32 名；年齡22～71 歲，平均（43.34±6.82）歲。兩組年齡、性別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 治療方法

研究組給予0.15 mg/（kg·d）的地塞米松（廠家：辰欣藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：1509 092211；規(guī)格：5 mg/支）靜脈輸注，1 次/d 或0.8 mg/（kg·d）的甲潑尼龍（廠家：輝瑞制藥有限公司；批號(hào)：AT9833；規(guī)格：40 mg/支）靜脈輸注，1 次/d。病情好轉(zhuǎn)后改為1 mg/（kg·d）潑尼松（廠家：浙江仙琚制藥股份有限公司；批號(hào)：151124；規(guī)格：5 mg/片）頓服，一共連續(xù)治療4 周。

1.3 觀察指標(biāo)

采集研究組及對(duì)照組治療前后晨起空腹靜脈血2 mL。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)情況，鼠抗人CD45-PerCP-Cy5.5（批號(hào)：9247247）、CD3-APC（批號(hào)：561811）、CD4-FITC（批號(hào)：9239677）、PD-1-BV421（批號(hào)：565935）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD 公司，BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀來(lái)自美國(guó)BD 公司，流式分析軟件為BD FACSDiva Software。

隨訪患者4 周，觀察研究組治療前后血小板計(jì)數(shù)及CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率的變化。按治療效果將研究組分成3 個(gè)亞組[11]：完全反應(yīng)組即治療后血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L 且沒(méi)有出血；有效組即治療后血小板計(jì)數(shù)≥30×109/L 并且至少比基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)增加2 倍且沒(méi)有出血；無(wú)效組即治療后血小板計(jì)數(shù)<30×109/L 或者增加不到基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)的2 倍或者有出血。血小板計(jì)數(shù)均檢測(cè)2 次且兩次間隔7 d，結(jié)果取平均值。然后比較3 個(gè)亞組間CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性表達(dá)率的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間及組內(nèi)比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血小板計(jì)數(shù)比較

治療前，研究組血小板計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。治療后，研究組血小板計(jì)數(shù)較治療前升高，但研究組仍低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組治療前后血小板計(jì)數(shù)比較（×109/L，）

表1 兩組治療前后血小板計(jì)數(shù)比較（×109/L，）

2.2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較

治療前研究組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。治療后，研究組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率較治療前降低，但研究組仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%，）

表2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%，）

注：PD-1：程序性死亡因子-1

2.3 不同治療效果亞組間CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性表達(dá)率比較

完全反應(yīng)亞組共33 例，有效亞組共39 例，無(wú)效亞組共28 例。三組治療前CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。治療后，完全反應(yīng)組和有效組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性表達(dá)率均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），無(wú)效組治療前后CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。三組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），完全反應(yīng)組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率低于有效組和無(wú)效組，有效組低于無(wú)效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

ITP 是一種臨床常見(jiàn)的出血性疾病，約占全部出血性疾病的30%，該病發(fā)病率為（5～10）/10 萬(wàn)人口[12]。ITP 患者常有較為明顯的出血癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血，威脅生命；另一方面，目前該病無(wú)特效藥物，治療后易反復(fù)發(fā)作，因此需要進(jìn)行長(zhǎng)期維持性治療，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。

表3 不同治療效果組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%，）

表3 不同治療效果組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%，）

注：與有效組比較（t=9.141，aP <0.001）；與無(wú)效組比較（t=13.810，bP<0.001）；與無(wú)效組比較（t=7.398，cP <0.001）。PD-1：程序性死亡因子-1

現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)ITP 的主要發(fā)病機(jī)制是自身免疫失耐受所致體液免疫和細(xì)胞免疫異常，導(dǎo)致血小板破壞增加、生成減少[13-15]，其中自身T 細(xì)胞免疫失耐受起著重要的作用，主要表現(xiàn)在血小板自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)度增殖活化、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量及功能異常、輔助性T 細(xì)胞異常等。PD-1 即CD279，為CD28 超家族的成員，其缺乏近膜端半胱氨酸殘基，因此常以單體形式主要表達(dá)在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞等表面，在維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用。PD-L1和PD-L2 是PD-1 的兩個(gè)配體，PD-L1 主要在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)，而PD-L2 主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞表面[16-17]。目前許多研究表明，PD-1/PD-L1 是T 細(xì)胞重要的負(fù)性調(diào)控信號(hào)，一旦表達(dá)異常將會(huì)造成自身免疫調(diào)節(jié)失衡、免疫耐受被破壞[18]，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[19-20]。但目前關(guān)于PD-1 與ITP 的相關(guān)性研究仍較少。

本研究結(jié)果顯示，ITP 患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后，ITP 患者血小板明顯升高，但其仍低于對(duì)照組，CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性率明顯降低，但其仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。且本研究結(jié)果顯示，治療后完全反應(yīng)和有效組CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P >0.05），而無(wú)效組PD-1 陽(yáng)性率與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），提示治療反應(yīng)越好者其治療后CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 陽(yáng)性率下降越明顯，提示CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)可能與ITP 患者體內(nèi)的免疫失衡程度有關(guān)，其表達(dá)升高可能是機(jī)體自身的代償性負(fù)反饋。本研究結(jié)果與常規(guī)理論推斷自身免疫性疾病患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 比例應(yīng)該會(huì)下降不符，但與Stefanski 等[20]關(guān)于ITP 患者的研究結(jié)果一致。Wang 等[21]研究顯示新發(fā)ITP 患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 比例升高并且PD-1/PD-L1 升高與ITP 患者疾病活動(dòng)程度之間有一定關(guān)系。也有許多關(guān)于其他自身免疫病的研究發(fā)現(xiàn)外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1 比例升高，且與疾病的活動(dòng)度可能相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[19-20]。

綜上所述，ITP 患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)增高，可能與ITP 患者體內(nèi)的免疫失衡程度有關(guān)。糖皮質(zhì)激素治療能減低其表達(dá)，其降低水平與ITP 治療反應(yīng)程度有關(guān)。但鑒于ITP 發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜多樣性，因此該指標(biāo)是否可以用作ITP 患者疾病發(fā)展程度及預(yù)后的評(píng)估尚需進(jìn)一步深入研究。