姜黃素對帕金森模型大鼠損傷神經元的修復作用及相關機制研究

郭 森， 張 碩， 付慧霄， 劉 偉， 李 靜， 朱 江， 張 弛

帕金森是一種臨床較為常見的神經系統退行性病變。主要臨床表現為運動遲緩、四肢震顫等[1,2]。老年人群為帕金森癥狀的高發群體，近年來，我國帕金森發病率居高不下[3,4]。帕金森癥狀發病機制相對較為復雜，目前臨床醫學尚未將帕金森發病機制研究透徹，因此尚無一種特效的治療帕金森的手段[5]。本文研究中設計動物實驗，建立帕金森大鼠模型，使用姜黃素進行干預，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，年齡8～10月，平均(9.0±0.9)m；體重225～238 g，平均體重(231.8±5.2)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.9 ℃±2.5 ℃)的環境中喂養1 w，光照12 h/d。主要試劑：兔抗小鼠IL-6、IL-1β抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠TNF-α抗體(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機選取10只大鼠為正常組，不做處理。其余30只建立帕金森模型：將魚藤酮在葵花油乳油中溶解，濃度2 mg/ml，之后對大鼠進行頸背部皮下注射，劑量2 mg/(kg·d)，1次/d，連續注射28 d。對大鼠行為學進行觀察檢測，大鼠肢體僵直、震顫、步態不穩、行動遲緩可視為建模成功。共建模成功28只，將28只帕金森模型大鼠隨機分為模型組10只以及低、高劑量組各9只。正常組、模型組大鼠使用生理鹽水進行灌胃處理，低、高劑量組大鼠分別使用20 mg/kg、60 mg/kg姜黃素提取物溶液進行灌胃處理，1次/d，連續干預14 d。

1.2.2 學習記憶能力檢測 準備高50 cm、直徑150 cm圓形水池，并分別標記4個點位，注入半池水，水溫27 ℃。準備高30 cm、直徑10 cm平臺置于水池中央。分別于已標記4點位處將大鼠置入水中，統計各組大鼠自入水點游至預置平臺時間，將120 s內未游至平臺的大鼠引至平臺，潛伏期記為120 s。大鼠在平臺上停留30 s之后，將其置于其他不同入水點重新測試。所有大鼠均連續測試4 d，第5天撤除平臺，將大鼠自入水點放入水中，記錄60 s內大鼠穿越平臺位置次數。

1.2.3 標本制備、HE染色 取各組大鼠尾部靜脈血1 ml,2000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環境中保存待檢。對各組大鼠進行麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取大鼠腦組織，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片。首先將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察，并對神經元大小、數量進行統計。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平 設置10個標準孔，設置1個空半空及若干待測樣品,在10 μl待測樣品中加入40 μl樣本稀釋液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環境下顯色15 min，在反應孔內加入終止液50 μl/孔以終止反應，450 nm波長測量每孔吸光度，檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織病理學觀察 與正常組比較，模型組大鼠腦組織細胞出現較為嚴重的腫脹、破裂狀況，細胞排列不規則；低劑量組、高劑量組大鼠腦組織細胞腫脹、破裂狀況出現緩解，且高劑量組大鼠腦組織細胞排列較規則，細胞腫脹、破裂狀況情況相對較輕(見圖1)。

2.2 各組大鼠神經元大小、數量比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠神經元大小、數量較低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組大鼠神經元大小、數量較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠神經元大小、數量較高，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.3 各組大鼠學習記憶能力比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠各時間點逃避潛伏期較長，穿越平臺次數較低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、低劑量組組比較，高劑量組大鼠各時間點逃避潛伏期較短，穿越平臺次數較高，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.4 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組、低劑量組比較，高劑量組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表1 各組大鼠神經元大小、數量比較

表2 各組大鼠學習記憶能力比較

表3 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

3 討 論

作為一種常見的神經內科疾病，帕金森發病后主要臨床表現為靜止性震顫、步態、姿勢障礙、運動障礙等[6,7]。目前臨床醫學尚未將帕金森的發病機制研究透徹，年齡因素、環境因素、家庭遺傳因素、氧化應激反應等均可能參與帕金森的發生發展[8,9]。藥物治療是臨床常用的治療帕金森的手段，有研究表示，抗精神疾病藥物多具有一定的藥物毒性，可能會對患者肝腎功能造成一定的損傷，治療安全性并不理想，因此越來越多的專家學者致力于中醫藥治療帕金森的研究[10,11]。作為一種由天南星科、姜科植物中提取出的多酚化合物，姜黃素具有消炎、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、神經保護等藥理作用[12,13]，但是關于將姜黃素應用于帕金森臨床治療的研究還相對較少。

帕金森癥狀的發生發展對機體認知功能、神經功能造成嚴重的影響。許多學者通過設計水迷宮動物實驗對動物模型學習記憶能力進行檢測。余恒[14]等在研究中建立帕金森大鼠模型，并設計水迷宮實驗對學習記憶能力進行檢測，得出有效的干預能夠改善帕金森大鼠學習記憶能力，發揮神經功能保護作用的結論。本研究中設計水迷宮實驗，結果顯示，帕金森大鼠逃避潛伏期較長，穿越平臺次數少，說明帕金森癥狀的發生發展會對大鼠神經功能造成較大損傷，嚴重影響學習記憶能力。使用高劑量姜黃素進行干預的帕金森大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數增加，說明使用高劑量姜黃素進行干預能夠減輕帕金森大鼠神經損傷程度，使大鼠學習記憶能力提升，具有一定的神經保護作用。本文研究中還對帕金森大鼠腦組織神經元大小、數量進行檢測，結果顯示，使用高劑量姜黃素進行干預的帕金森大鼠腦組織神經元大小、數量均明顯上升，說明姜黃素能夠改善帕金森大鼠神經元大小、數量，具有一定的神經保護作用。

帕金森癥狀的發生發展與機體腦組織炎癥反應密切相關[15～17]。IL-6、IL-1β、TNF-α均為TLR4/NF-κB信號通路的下游因子，TLR4/NF-κB信號通路在機體炎癥反應發生發展過程中發揮重要作用，因此IL-6、IL-1β、TNF-α在機體炎癥反應過程中發揮重要作用。本文研究結果顯示，使用高劑量姜黃素對帕金森模型大鼠進行干預，大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平出現明顯下降，說明使用高劑量姜黃素進行干預，能夠減輕帕金森腦組織炎癥反應，從而減輕神經損傷嚴重程度，發揮神經保護作用。

綜上所述，使用姜黃素對帕金森模型大鼠進行干預，能夠改善大鼠學習記憶能力，提升大鼠腦組織神經元大小、數量，發揮神經元損傷修復作用，其功能可能與減輕腦組織炎癥反應，調控細胞自噬、細胞凋亡蛋白表達有關，為帕金森的臨床治療提供一定的理論依據。

正常組 模型組 低劑量組 高劑量組