分化型甲狀腺癌術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與刺激性甲狀腺球蛋白相關(guān)性的研究

張富強(qiáng)， 智建潮， 李德宇， 丁獻(xiàn)敏， 楊光， 楊輝*

（1 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院／河南省腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科， 河南 鄭州450003；2 河南省虞城縣人民醫(yī)院 腫瘤科， 河南 商丘476300）

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升， 根據(jù)2014 年美國(guó)監(jiān)測(cè)、 流行病學(xué)及預(yù)后項(xiàng)目數(shù)據(jù)， 甲狀腺癌發(fā)病率為12.90／10萬(wàn)， 甲狀腺癌的預(yù)后較好、 生存率高， 對(duì)于病灶局限于甲狀腺內(nèi)的患者， 5 年生存率達(dá)99.90%， 但有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者則明顯降低， 僅為54.70%［1－3］。 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （CTCs） 檢測(cè)能盡早發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移， 有助于準(zhǔn)確判斷甲狀腺癌預(yù)后、 指導(dǎo)個(gè)體化治療、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。 本研究回顧性分析131 例甲狀腺癌患者的資料， 探討分化型甲狀腺癌術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè) （CTCs） 與刺激性甲狀腺球蛋白 （sTg） 二者之間的相關(guān)性， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2019 年1 月至2019 年12 月我院收治的131 例甲狀腺癌患者的臨床資料， 男49 例， 女82 例， 年齡9 ～81 歲， 平均 （45.95 ± 14.83） 歲。 所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診為分化型甲狀腺癌， 其中乳頭狀癌121 例、 濾泡癌10 例。

1.2 研究方法①刺激性甲狀腺球蛋白 （sTg） 檢測(cè)： 所有患者住院前均停服優(yōu)甲樂2 ～4 周， 血清TSH＞30 mIU／L。 住院后空腹?fàn)顟B(tài)下抽取患者肘靜脈血5 mL， 離心15 min 分離血清， 采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清sTg 水平。 按sTg 結(jié)果分為sTg＜2 ng／mL 組 （A 組）， 2 ng／mL≤sTg＜10 ng／mL 組 （B 組）、10 ng／mL≤sTg ＜50 ng／mL 組 （C 組）、 sTg≥50 ng／mL 組 （D組）。 ②分離富集CTCs： 由我院分子病理實(shí)驗(yàn)室完成， 具體步驟［4］： 將每個(gè)受試者的5 mL 血液樣本收集到EDTA 抗凝管中，然后使用紅細(xì)胞裂解緩沖液裂解紅細(xì)胞， 并用直徑為8 μm 的孔校準(zhǔn)膜過濾。 過濾后， 將剩余的細(xì)胞重懸于含有4%甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水中5 min， 轉(zhuǎn)移至濾管中， 并再次過濾。 抽氣閥設(shè)置為產(chǎn)生至少0.08 MPa 的真空壓力。 ③原位雜交分析： 該測(cè)定法在24 孔板中進(jìn)行， 其上富集的細(xì)胞用蛋白酶處理， 然后與上皮生物標(biāo)記物EpCAM 和CK8／18／19、 間質(zhì)生物標(biāo)志物Vimentin 和Twist、 白細(xì)胞生物標(biāo)志物CD45 特異的捕獲探針雜交。 記錄循環(huán)腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)， 結(jié)果≥5 個(gè)判讀為陽(yáng)性結(jié)果。 ④病例隨訪： 對(duì)患者進(jìn)行隨訪觀察， 每3 ～6 個(gè)月行連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察， 必要時(shí)行頸部淋巴結(jié)、 肺部結(jié)節(jié)穿刺活檢， 取得病理結(jié)果從而明確患者診斷。

1.3 觀察指標(biāo)①CTCs 檢測(cè)陽(yáng)性率。 ②不同sTg 濃度組的CTCs檢測(cè)陽(yáng)性率。 ③CTCs 檢測(cè)結(jié)果和sTg 濃度之間的相關(guān)性。 ④繪制ROC 曲線， 確定臨界值并評(píng)估診斷效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。 計(jì)量資料均行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗(yàn)， 符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s 表示， 符合非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)、 極大值和極小值表示。 雙偏態(tài)變量數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用Spearman 法分析；各種率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。 以穿刺病理確診結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)將CTCs 檢測(cè)結(jié)果繪制ROC 曲線； P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTCs 檢測(cè)陽(yáng)性率以及CTCs 檢測(cè)與sTg 濃度相關(guān)性131例患者共檢出2 400 個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞， 中位數(shù)10 個(gè)， 最小0 個(gè)，最大131 個(gè)。 按≥5 個(gè)為陽(yáng)性結(jié)果， 陽(yáng)性率73.3% （96／131）（典型病例見圖1）。 sTg 濃度中位數(shù)6.97 ng／mL （0.02 ～895.62）。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示， CTCs 檢測(cè)結(jié)果和sTg 濃度雙變量之間呈顯著性正相關(guān) （r ＝0.418， P ＜0.01）。

圖1 甲狀腺癌CTCs 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性典型圖像

2.2 各組間CTCs 檢測(cè)陽(yáng)性率比較D 組的CTCs 陽(yáng)性率顯著高于其他三組， B、 C 組顯著高于A 組 （P ＜0.05）， B、 C 組間無顯著性差異 （P ＞0.05）。 見表1。

表1 各組間的CTCs 檢測(cè)陽(yáng)性率比較

2.3 ROC 曲線分析與臨界值確定及診斷效能評(píng)估以穿刺活檢及多種影像學(xué)確診結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)， 將CTCs 檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線 （圖2）， 以約登指數(shù)最大點(diǎn)對(duì)應(yīng)的臨界值決定CTCs 檢測(cè)的臨界值為4.5 個(gè)CTCs 計(jì)數(shù)／5 mL。 CTCs 檢測(cè)的敏感度91.1%，特異性為78.0%， AUC 為0.907 （95%CI： 0.845 ～0.969）。

圖2 ROC 曲線分析CTCs 檢測(cè)結(jié)果的診斷效能

3 討論

近年來研究［5］表明， 甲狀腺癌患者TgAb 陰性狀態(tài)下低水平sTg 預(yù)示較低的復(fù)發(fā)率及較好的預(yù)后， 但是sTg 受到殘留甲狀腺等因素的影響， 其水平高低及動(dòng)態(tài)變化與疾病的緩解、持續(xù)及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。 國(guó)內(nèi)一項(xiàng)大樣本回顧性研究［6］結(jié)果顯示sTg 特異度僅為67.3%。 丁獻(xiàn)敏等［7］檢測(cè)首次131I 治療前sTg 濃度以預(yù)測(cè)甲狀腺?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移， 結(jié)果顯示6 例假陰性， 患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶， 但是sTg 水平很低。 以上研究結(jié)果表明單純依靠sTg 和131I 全身顯像來預(yù)測(cè)分化型甲狀腺癌微轉(zhuǎn)移是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的。 自從19 世紀(jì)Ashworth 首次在靜脈血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞并提出微轉(zhuǎn)移的理論， 經(jīng)過多位學(xué)者的研究［8－9］， CTCs 技術(shù)逐漸成為臨床熱點(diǎn)； 傳統(tǒng)的CellSearch 方法對(duì)DTC 敏感性較低，本研究使用分離富集和原位雜交 （iFISH） 技術(shù)， 大大提高了分化型甲狀腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性。 盡管本研究表明sTg 偏高的甲狀癌患者外周血檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞， 但是樣本量少， 未能系統(tǒng)化研究； 本研究對(duì)影像學(xué)難以發(fā)現(xiàn)的隱匿性轉(zhuǎn)移灶 （＜2 mm） 尋求一種有效的生物學(xué)指標(biāo)用來檢測(cè)和評(píng)估甲狀腺癌早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)， 可實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺癌的精準(zhǔn)化治療。

綜上所述， CTCs 檢測(cè)結(jié)果與sTg 濃度呈顯著正相關(guān)， 外周血CTCs 檢測(cè)能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分化型甲狀腺癌的早期轉(zhuǎn)移， 可為分化型甲狀腺癌分期、 預(yù)后及治療提供重要依據(jù)。