基于生物信息學驗證CCR5參與類風濕關節炎發生發展的遺傳學和組織學證據

王友強，蘭由玉，李世勇

（西南醫科大學：1附屬中醫醫院檢驗科；2附屬醫院風濕免疫科，四川瀘州 646000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是系統性自身免疫性疾病，以關節及其周圍組織受累為主，多種致病因素參與了RA 的發病，隨著疾病的進展，可導致患者關節畸形及其生活質量的嚴重下降[1-2]。CC 趨化因子受體5（C-C chemokine receptor 5，CCR5）是一種G 蛋白偶聯受體，可通過調節白細胞的趨化活性在免疫和炎癥反應中發揮重要作用[3-4]，但關于CCR5 在RA 中的具體作用機制還有待進一步的研究。隨著高通量生物醫學實驗方法的廣泛應用，使深入研究疾病的分子機制成為現實，如生物信息學網絡分析可幫助發現RA 診治的潛在靶點[5-7]。本研究擬利用生物信息學分析GEO中RA相關的基因芯片數據，篩選RA 差異基因，并從中探尋CCR5在RA患者的表達情況及其在RA中可能的作用，以此驗證CCR5參與RA發病的遺傳學證據；再通過實驗驗證CCR5在RA大鼠異常表達的組織學證據，從而為后續進一步的探究CCR5 的作用機制研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數據來源及在線分析工具如下：

GEO：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；

GEO2R：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/；

limma包：http：//master.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html；

jvenn：http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html。

1.1.2 實驗動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠20 只，體重（171 ± 8）g，購買于西南醫科大學實驗動物中心，實驗通過了西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.3 主要試驗試劑及儀器

弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）（美國，Sigma公司）、Trizol Reagent（日本，Taka?ra 公司）、逆轉錄試劑盒（美國，Promega 公司）、轉膜液（上海碧云天生物技術有限公司）、CCR5 抗體（英國，Abcam公司）、二抗（兔抗羊IgG）（英國，Abcam公司）、PCR 試劑盒（日本，Takara 公司）、ABI7500 定量PCR 儀（美國，ABI 公司）、WB 顯像儀（美國，BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學篩選RA差異基因

在GEO數據庫中以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞檢索RA 的基因芯片，GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457 和GSE 1919 這5 個數據集被用于差異基因篩選，數據集的樣本、注釋平臺等詳細信息見表1。GEO2R 和limma 包對數據信息進行分析，以P.Value ＜0.05 和|Log Fold Change|＞2 的基因被確定為差異表達基因，jvenn 是web 環境的開源組件，可以對含有不同元素的集合進行比較并繪制Venn圖，這里用jvenn比較5個基因芯片的差異基因。

表1 類風濕性關節炎數據集信息

1.2.2 RA大鼠模型構建

將選購的SPF級Wistar雄鼠20只，體重（171±8）g，飼養1周后再隨機分配為Control和RA 兩組，每組各10只。RA組的10只Wistar雄鼠用于構建RA大鼠CIA模型。具體方法為：將Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于濃度為0.1 mmol/L 的醋酸溶液中，然后再將相同劑量的弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）充分與上述混合液一起混勻，最后放置在冰浴中待其完全乳化；用注射器在Wistar 雄鼠尾根部多處注射，同樣的方法再于1 周后重復操作一次；con?trol組的Wistar雄鼠在同樣的時間、同樣的部位僅注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg。采用關節炎癥指數(Arthri?tis index，AI)評分法評估RA 大鼠模型是否構建成功，AI大于或等于4分提示造模成功，四肢評分標準見表2，每隔5 d觀察一次。

表2 AI評分標準

1.2.3 HE染色

每組大鼠斷頸處死，逐漸剝離出膝關節滑膜組織后，經過固定、透明制作成石蠟切片。每組取5 張切片，先后經過脫蠟、乙醇梯度脫水及蒸餾水清洗后，用蘇木精上色5 min，水流沖刷3 s，再先后用鹽酸、水流分別沖刷清洗3 s，然后用伊紅染料室溫下著色2 min，去除染色液后分色2～3 s，經清洗、返藍后，伊紅再次上色1 min。將上述處理過的切片再先后予以梯度脫水、透明化、封片處理后鏡檢。鏡下觀察切片，胞核表現為藍色，胞質則為紅色。

1.2.4 免疫組化檢測CCR5 在大鼠滑膜組織的表達情況

每組取5 張切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，室溫下，3%的H2O2溶液浸泡切片10 min后，用蒸餾水洗滌切片，每次5 min，共3次。再將切片放在含有枸櫞酸鹽Buffer（pH=6.0，0.01 nmol/L）的容器中充分浸泡，然后進行抗原修復。常溫下，切片用正常羊血清（PBS 稀釋至濃度為10%）封閉15～20 min，去除血清后再滴入一抗溶液（羊抗鼠的CCR5抗體），4 ℃過夜。PBS 清洗后滴入PBS 稀釋的生物素標記的二抗（兔抗羊IgG），常溫30 min。PBS 洗滌后加入鏈霉素卵蛋白工作液，常溫擱置30 min。PBS 洗滌5 min×4次，DAB 顯色處理后，用水沖洗，然后蘇木素再次染色，乙醇梯度脫水，透明化處理，封片后光鏡下觀察。

1.2.5 CCR5 mRNA及蛋白水平的檢測

各組滑膜組織用Trizol 法提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，再以GAPDH 為內參基因，將cDNA 進行PCR 擴增，反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環，引物序列見表2?；そM織加入蛋白裂解液提取蛋白，再利用10%SDS分離膠與濃縮膠電泳分離、轉膜，滴加稀釋的一抗兔抗鼠CCR5，4 ℃孵育過夜；加入二抗37 ℃振蕩孵育l h后用化學發光儀檢測。

表2 引物基因序列

1.3 統計學方法

用SPSS 21.0 分析所得數據，定量數據以均值±標準差（）表示，兩個樣本均數比較采用t 檢驗，以P ＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學篩選RA 差異基因以及CCR5 在RA患者的表達情況

GEO 數據庫中RA 芯片GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457和GSE 1919篩選差異表達基因，篩選條件為P.Value ＜0.05 和|LogFoldChange| ＞2。在GSE 1919中，CCR5在RA組中的量是control組的5.74倍（22.52），說明RA患者CCR5的表達量明顯高于正常人（P ＜0.05），如圖1A；繪制GSE 77298 前70個差異基因的表達熱圖（圖1B）提示CCR5 在RA 中的表達比control 組高；另外在GSE 97779、GSE 10500 和GSE 55457 芯片中，CCR5 的表達情況分別如圖1C-1E所示，CCR5在RA患者中異常高表達。最后選取每種芯片前400 個基因進行比較，繪制Venn圖（圖1F）發現有1個交集基因-CCR5，說明CCR5在5個芯片均差異表達，可能是影響RA的一個重要因子。

圖1 生物信息學篩選結果及CCR5相對表達量的比較

2.2 RA大鼠模型鑒定

在給大鼠注射弗氏完全佐劑（CFA）8 h 后，RA組大鼠在注射一側足趾部位出現紅腫等關節炎癥的表現，24 h 出現足踝部腫脹。10 d 后RA 模型大鼠表現出多關節炎，具體表現為前肢或對側肢體，甚至耳部和尾部均有前面所述的炎癥反應的表現。皮毛缺少光澤，體重減輕，精神稍萎靡，隨著時間的延長，少數還可見脫皮、潰瘍等。10 d后RA組大鼠AI明顯升高，且隨時間增加逐漸上升（P ＜0.05），至25 d 時AI（7.12±1.13）較10 d（1.21±0.73）、15 d（4.87±1.21）時進一步增高（P ＜0.05），見圖2。而對照組大鼠無關節炎癥等表現。由此可見RA大鼠模型構建成功。

2.3 RA大鼠滑膜組織病理形態變化

HE染色顯示，與control組對比，RA組關節內滑膜增生，部分滑膜剝脫缺失，關節間隙稍增寬，骨及軟骨輕微破壞，并向關節腔內突出，有較多炎性細胞浸潤，軟組織明顯腫脹，可見新生血管翳形成，由此進一步提示RA大鼠模型構建是成功的。

圖2 RA組大鼠關節炎指數（AI）

圖3 RA大鼠滑膜組織病理形態比較

2.4 免疫組化測定CCR5在大鼠滑膜組織的表達情況

為證實CCR5 在RA 大鼠滑膜組織中的表達情況，如圖3所示，本研究利用免疫組化染色方法可以更直觀的了解CCR5 在大鼠滑膜細胞的表達情況，與對照組相比，RA 組CCR5 陽性率明顯增加（P ＜0.001），說明CCR5在RA中表達增加，與生物信息學結果一致。

圖4 免疫組化染色及CCR5陽性率比較

2.5 CCR5 mRNA和蛋白水平的表達情況

利用qRT-PCR 和Western Blot 方法進一步了解CCR5 mRNA和蛋白水平在RA大鼠滑膜組織中的表達情況，如圖4 所示，與對照組對比，RA 組CCR5 mRNA 和蛋白水平明顯升高（P ＜0.05），由此可知，生物信息學分析結果與實驗結果一致，進一步表明RA大鼠CCR5表達水平是明顯升高。

圖5 各組滑膜組織CCR5 mRNA和蛋白水平的表達情況及比較

3 討論

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性進行性自身免疫性疾病，與多種遺傳、表觀遺傳學和環境因素有關，這些因素可影響關節，從而導致軟骨和骨骼損傷，最終出現關節畸形和殘疾[8-9]。盡管RA的病機尚不清楚，但有研究顯示其慢性關節發炎歸因于滑膜細胞的嚴重增殖、滑膜炎以及免疫細胞的浸潤等[10-11]，并且滑膜細胞在RA 的炎癥和增殖過程中具有重要作用[12-13]。

CCR5，即CC-趨化因子受體5，是G蛋白偶聯受體（GPCR），屬于趨化因子受體家族，其主要功能是通過調節白細胞的活化和定向遷移來調控免疫炎癥反應[14]。有研究[15-16]發現RA患者CCR5的表達是增加的，這與生信分析結果一致。有研究者利用生物信息學發現，CCR5、CCR7、CXCR4、CCL5和CCR4等關鍵基因參與了RA的疾病進展，其中趨化因子信號通路是介導成纖維樣滑膜細胞（FLS）遷移、侵襲和釋放趨化性的關鍵途徑，是RA主要的信號通路之一[6],并且還發現CCL5及其相關基因可能是RA治療策略的潛在生物標志物[17]。

本研究從GEO中篩出RA芯片數據集GSE 97779、GSE 77298、GSE 10500、GSE 55457 和GSE 1919，分別用GEO2R 和limma 包篩選RA 差異基因發現有較多差異基因，有待進一步確定關鍵基因。但Venn 圖的結果發現有1 個交集基因中有且僅有一個基因——CCR5，說明CCR5 是5 個芯片中唯一共有的差異基因，提示其可能是影響RA 的一個關鍵基因。生物信息學分析還提示，CCR5 在RA 患者中的表達明顯比對照組高，說明CCR5 在RA 患者中是高表達的，可能參與了RA的發病，由此可見，利用生物信息學方法驗證CCR5 參與RA 發生發展的遺傳學證據是可行的，同時為發現RA的分子機制和診治目標提供線索和方向[18-19]。

為進一步驗證CCR5在RA大鼠的表達情況，研究通過RT-PCR、Western Blot 以及免疫組化檢測發現，CCR5在RA大鼠滑膜組織中高表達，這與生物信息學分析結果一致，同時也為后續利用RA大鼠模型研究CCR5具體的作用機制奠定了基礎。

4 結論

本研究發現CCR5 在RA 患者中呈異常高表達水平，且參與了RA 發病，進一步的實驗驗證發現CCR5 在RA 大鼠滑膜組織也是高表達的，這為下一步利用RA 大鼠模型研究CCR5 的具體作用機制奠定了基礎，同時也說明我們可以利用生物信息學發現RA的關鍵基因，并結合實驗方法驗證CCR5參與RA發生發展的遺傳學和組織學證據，從而為后續的機制研究奠定基礎，但CCR5在RA中的具體作用機制還有待進一步研究。