中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜實時熒光PCR法鑒別及其應用

（秦皇島海關技術中心，秦皇島 066004）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1-4]。中國是養蜂大國，中國蜜蜂主要由意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera，簡稱意蜂）和中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡稱中蜂）兩大種群組成[5,6]。意蜂原產于歐洲和非洲，因有較高的生產性能，于20世紀初引入我國，現已成為我國飼養的主要蜂種[7]。中蜂是我國本土蜜蜂，已在中國繁衍了數千年，多為黑色，個體較意蜂小。中蜂所產的蜂蜜為中蜂蜂蜜，其營養價值高，保健功能好，但是由于產量低，價格是普通意蜂蜂蜜的3～5倍[8]。一些不法企業和養蜂人趁機將意蜂蜂蜜假冒中蜂蜂蜜銷售，或將意蜂蜂蜜摻入到中蜂蜂蜜中以次充好[9,10]，這樣不僅侵害了廣大消費者的利益，而且破壞了公平競爭的蜂產品市場秩序。

因此，如何鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是當前蜂產品行業亟待解決的一大問題。前人研究發現中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在烷烴成分、王漿主蛋白種類方面存在較明顯的差異，并建立了相應的鑒別方法。Won等發現王漿主蛋白MRJP1在中蜂和意蜂蜂蜜中具有不同的分子量和表面結構[11]。Won等和Zhang等分析了中蜂和意蜂蜂蜜中的差異蛋白并制備了特異性的抗體，通過免疫學方法對二者做了鑒別[10,12]。基于蜂蠟組分差異的鑒定方法也是確定蜂蜜蜂種來源的方法之一。Zuccato等利用1H-NMR方法分析了無刺蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的氯仿提取物，發現蜂蠟中的特異標記物可用來鑒別兩種蜂蜜[13]。Zhang等發現中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的烴類特征性成分分別為三十五烯烴（17-Pentatriacontene）和三十一烷烴（Hentriacontane）[12]。

蜂蜜中含有蜜蜂的DNA，因此可用于蜂蜜的昆蟲學來源鑒定[14,15]。以細胞色素C氧化酶為靶標基因，Kim等開發了一種雙重PCR法來區分韓國本土蜂蜜和歐洲蜂蜜[16]。Soares等通過設計擴增tRNAleucox2間隔區的引物來鑒定中蜂蜂蜜，并通過建立16S rRNA靶基因的高分辨率熔解曲線來區分中蜂和意蜂蜂蜜[6]。Zhang等設計篩選了蜂種特異性引物，建立了用實時熒光PCR-SYBR Green染料法鑒別中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的體系，并發現該DNA分析不受蜜源植物種類和蜂蜜產地的影響[17]。為了提高檢測方法的特異性，我們以MRJP2為靶標基因開發了實時熒光PCR-Taqman探針法[18,19]，通過設計特異性的引物探針來區分意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜，該方法操作更簡便、檢測更快速，并且靈敏度高、特異性強，可有效解決中蜂蜂蜜摻假問題，為維護市場秩序、保護消費者和相關蜂蜜企業的合法權益提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

引物與熒光探針購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，TaqmanTMGene Expression Master Mix（4369016）購自ABI公司。本文用于方法特異性和靈敏度分析的蜜蜂和蜂蜜樣品直接由蜂農提供，用于中蜂蜂蜜真實性鑒別的樣品主要購自淘寶網或京東商城，實時熒光PCR儀為ABI Steponeplus，PCR產物送至北京擎科新業生物技術公司進行測序。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜和蜜蜂DNA 的提取

取15g蜂蜜樣品于50ml離心管中，加入30ml去離子水充分混勻，45℃溫育5min，6000rpm 離心10min，棄上清，向沉淀中加入2ml超純水，將沉淀充分懸起，轉移至2ml離心管中，12000rpm離心2min，棄上清，沉淀用于DNA提取，DNA提取按照CTAB法進行。用Nano Drop 2000C（Thermo）測定DNA濃度，蜜蜂DNA的提取參照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根，DP304）說明書進行。

1.2.2 引物探針設計軟件

用Primer Express 3.0軟件設計針對中蜂和意蜂的特異性引物探針，序列見表1。

表1 檢測中蜂和意蜂的引物與探針

1.2.3 實時熒光PCR 反應

實時熒光PCR擴增體系為：2×TaqmanTMGene Expression Master Mix（ABI，4369016）12.5μl；ddH2O 7.5μl；上下游引物、熒光探針（10μM）各1μl；最后加入2μl的DNA模板，總體積為25μl。每個樣品做兩到三個平行，并設置陰性對照與空白對照。反應程序為：50℃ 2min，95℃ 10min；然后95℃ 15s，60℃ 1min，共45個循環。實時熒光PCR利用儀器自帶的軟件進行結果分析，根據陰性對照結果設定閾值線，擴增曲線及樣品Ct值由軟件自動生成。

2 結果分析

2.1 實時熒光PCR檢測方法的特異性分析

提取中蜂的基因組，分別用擴增意蜂和中蜂的引物探針進行PCR反應，結果發現僅用中蜂的引物探針有擴增，而用意蜂的引物探針無擴增，PCR產物測序表明為中蜂基因片段，說明中蜂引物探針具有特異性（圖1A）。提取意蜂的基因組，分別用擴增意蜂和中蜂的引物探針進行PCR反應，結果發現僅用意蜂的引物探針有擴增，而用中蜂的引物探針無擴增，PCR產物測序表明為意蜂基因片段，說明意蜂引物探針具有特異性（圖1B）。

圖1 中蜂（A）和意蜂（B）實時熒光RT-PCR檢測特異性分析

提取中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜基因組，分別用擴增意蜂和中蜂的引物探針進行PCR反應，結果發現兩者無交叉擴增，進一步表明中蜂和意蜂引物探針具有特異性（圖2）。

圖2 中蜂蜂蜜（A）和意蜂蜂蜜（B）實時熒光RT-PCR檢測特異性分析

2.2 實時熒光PCR檢測方法的靈敏度分析

提取中蜂蜂蜜的基因組，測定DNA濃度為50ng/L，對DNA原液依次進行10倍稀釋，共稀釋4個梯度，每個稀釋梯度取2L作為PCR反應的模板，每個稀釋度設置三個平行，分別得到100、10、1、0.1、0.01ng樣品的擴增曲線，結果顯示中蜂蜂蜜的最低檢測限為0.01ng（圖3）。提取意蜂蜂蜜的基因組，DNA濃度為25ng/L，對DNA原液依次進行10倍稀釋，共稀釋4個梯度，每個稀釋梯度取2L作為PCR反應的模板，每個稀釋度設置三個平行，分別得到50、5、0.5、0.05、0.005ng樣品的擴增曲線，結果顯示意蜂蜂蜜的最低檢測限為0.05ng（圖4）。

圖3 中蜂蜂蜜實時熒光PCR檢測靈敏度分析

圖4 意蜂蜂蜜實時熒光PCR檢測靈敏度分析

2.3 市售中蜂蜂蜜的真實性鑒別

提取市售的54個中蜂蜂蜜樣品基因組，分別進行中蜂和意蜂蜂蜜成分檢測，每個樣品做兩個平行，結果發現20個樣品為真實的中蜂蜂蜜，不含意蜂蜂蜜成分，占比為37%。32個樣品均含有意蜂蜂蜜成分，其中24個樣品為意蜂蜂蜜，不含有中蜂蜂蜜成分；另外8個樣品為混合蜜，既含有中蜂蜂蜜成分，又含有意蜂蜂蜜成分，其中RS-13、19、32號樣品以意蜂蜂蜜成分為主，RS-22、25、54號樣品以中蜂蜂蜜成分為主，RS-14、24號樣品意蜂和中蜂蜂蜜各占約50%。RS-40、49兩個樣品中蜂和意蜂蜂蜜成分均未檢測到（表2）。

表2 對市售54個中蜂蜂蜜的檢測結果

3 討論

實時熒光定量PCR技術以其靈敏度高、速度快、特異性強的優點，在基因表達水平分析、多態性研究、物種特異性檢測等方面具有廣泛應用[20,21]。本文建立的實時熒光PCR方法對中蜂和意蜂蜂蜜DNA的最低檢測限分別達0.01和0.05ng，采用CTAB法提取的蜂蜜DNA濃度一般為幾十ng/μl，這與前人試驗中的濃度2.3～303.9ng/μl基本一致[6]，因此完全可以滿足檢測的需求。Zhang等建立的普通PCR方法鑒別意蜂蜂蜜，檢測限為0.1ng，靈敏度要比我們的略低[17]。提取的蜂蜜基因組中既含有花粉DNA，還含有蜜蜂DNA成分，本研究以真核生物18S rRNA基因為內參基因來判斷蜂蜜DNA的提取效果，擴增Ct值在15～27，說明蜂蜜基因組提取效果較好。對中蜂蜂蜜摻假情況檢測發現，市場上真實的中蜂蜂蜜僅占37%，其余均混雜不同比例的意蜂蜂蜜成分，說明中蜂蜂蜜摻假現象較普遍，嚴重破壞了公平競爭的市場秩序。本文建立的實時熒光PCR方法可為中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的準確鑒別提供有效的技術支撐。此外，目前我們未對中蜂蜂蜜中的意蜂蜂蜜摻假比例進行詳細研究，下一步將通過定量方法解決這一問題。