龍膽苦苷對非小細胞肺癌的炎癥因子水平及上皮間質轉化的影響

鐘春蕾,黃國濤,楊洋,申思,張志強

（1.新鄉醫學院第一附屬醫院呼吸內科二病區，河南衛輝453100；2.新鄉醫學院第一附屬醫院心內科二病區，河南衛輝453100）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,也是導致癌癥死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(non?small cell lung cancer,NSCLC)幾乎占所有肺癌的80%[2]。由于轉移,預后較差,治療選擇有限[3]。癌細胞轉移是癌癥死亡的主要原因,并且是涉及入侵和遷移的復雜的多步驟過程[4?5]。在許多情況下,晚期NSCLC患者預后不良和治療失敗是造成從原發部位到遠處器官的局部浸潤或轉移的原因[6]。盡管在過去的幾十年中早期診斷的改善和鉑類化學療法的發展,NSCLC患者的預后和存活率仍然不能令人滿意,因此,迫切需要制定預防轉移策略并尋找新的、安全有效的肺癌預防劑。長期以來,植物來源的天然產物一直被認為是抗癌劑的來源,并且正在針對幾種類型的癌癥進行評估。龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS)是龍膽草的活性成分之一,據報道具有多種藥理作用,包括抗炎[7]、保肝[8]和止痛[9]。最近,由于低毒的優勢,GPS作為抗肝癌[10]和卵巢癌[11]的潛在抗癌劑受到越來越多的關注,但GPS對人類NSCLC是否具有抑制作用及其潛在機制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS，美國Sigma);胎牛血清(FBS)、RPMI?1640培養基、胰酶(美國Invitrogen);TRIzol試劑(美國Thermo Fisher);CCK?8試劑盒、結晶紫、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL發光液(上海碧云天);白細胞介素(interleukin,IL)?6、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和IL?1β ELISA試劑盒(武漢博士德);P65、p?P65、β?actin、E?cad、N?cad和Vimentin兔抗單克隆抗體、山羊抗兔IgG(Alexa Fluor?488)熒光二抗(美國CST公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆IgG抗體(英國Abcam);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore);tran?swell小室(美國康寧);基質膠(美國BD);高速低溫離心機(美國Beckman公司);CO2培養箱、Nanodrop 2000(美國Thermo Fisher公司);流式細胞儀(美國BD Bio?sciences);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus);凝膠成像系統(上海天能)。

1.2 細胞培養

人非小細胞肺癌A549細胞系購自美國典型培養物保藏中心(ATCC),將細胞在含有10%(φ)胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RP?MI 1640中于37℃、含5%(φ)CO2濕潤條件下培養。

1.3 CCK8實驗檢測細胞活性

將A549細胞(每孔104個)接種到補充有10%FBS的100μL RPMI 1640中的96孔板中,并使其貼壁過夜。用不同濃度的GPS處理24 h后,將10μL CCK8溶液添加到平板的每個孔中。將板在37℃下孵育1 h,然后使用酶標儀測量450 nm處的吸光度（A）。所有實驗一式三份進行,并重復至少3遍。

1.4 ELISA檢測細胞上清液IL?6、iNOS和IL?1β的含量

將細胞(3×105/孔)鋪在6孔板上培養過夜后,用0、5、10、20μmol/L濃度(分別用a、b、c、d表示)的GPS處理細胞24 h后,收集細胞并用超聲儀裂解以制備細胞懸液。以1 000 g離心10 min后,取上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中IL?6、i NOS和IL?1β的水平。

1.5 免疫印跡檢測蛋白表達

將細胞(3×105/孔)鋪在6孔板上培養過夜后,用0、5、10、20μmol/L濃度的GPS處理細胞48 h后,用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。用Nanodrop 2000測量蛋白質濃度并調平后,用十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS?PAGE)分離蛋白質,然后將其轉移到PVDF膜上。接下來,將膜用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。然后,將膜與稀釋的一抗P65(1∶1 000)、p?P65(1∶1 000)、β?actin(1∶2 000)、E?cad(1∶1 000)、N?cad(1∶1 000)和Vimentin(1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST洗滌3次,并與HRP偶聯的二抗37℃孵育1 h。使用ECL并用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 Transwell分析檢測細胞侵襲

上部Transwell室中預涂稀釋的基質膠(BD),下部Transwell室添加0.5 mL含20%FBS的RPMI?1640培養基。將細胞用RPMI?1640培養基以5×105細胞/mL的密度懸浮,基質膠凝結后,然后將細胞懸液的等分試樣100μL接種到上部Transwell室。培養20 h后,將通過膜的細胞用甲醇和0.05%結晶紫染色。使用光學顯微鏡從5個隨機視野中確定侵襲細胞的數量。

1.7 免疫熒光檢測Vimentin陽性細胞

將A549細胞以5×104個細胞密度接種在96孔板中,用0、5、10、20μmol/L濃度的GPS培養48 h后,用PBS洗滌,將細胞與兔抗Vimentin單克隆抗體(1∶100)4℃孵育30 min,PBS洗滌3次,加入山羊抗兔熒光二抗避光孵育15 min。熒光顯微鏡下觀察Vimentin陽性細胞(綠色熒光)并拍照統計。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 龍膽苦苷對NSCLC細胞活力的影響

如圖1所示,GPS對非小細胞肺癌A549細胞的活力有抑制作用,隨著GPS濃度的升高,A549細胞存活率逐漸降低。選擇0、5、10、20μmol/L濃度的GPS進行后續實驗。

2.2 龍膽苦苷對NSCLC細胞炎癥因子分泌的影響

如圖2所示,與GPS 0μmol/L組相比,GPS10μmol/L和20μmol/L組A549細胞上清液中炎癥因子IL?6、iNOS和IL?1β水平顯著下降(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統計學意義。

2.3 龍膽苦苷對NSCLC細胞中NF?κBP65磷酸化的影響

圖1 GPS對NSCLC細胞活力的影響Figure 1 Effect of GPS on the viability of non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

如圖3示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS 10μmol/L和20μmol/L組A549細胞中NF?κB P65磷酸化水平顯著降低(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統計學意義。

2.4 龍膽苦苷對NSCLC細胞侵襲能力的影響

如圖4示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS10μmol/L和20μmol/L組A549細胞侵襲細胞數目明顯減少(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統計學意義。

2.5 龍膽苦苷對NSCLC細胞EMT的影響

如圖5所示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS10 μmol/L和20μmol/L組A549細胞中N?cad和Vimen?tin的蛋白表達顯著下調(P＜0.05),E?cad蛋白表達顯著上調(P＜0.05);免疫熒光染色結果示GPS 10μmol/L和20μmol/L組Vimentin陽性細胞數目明顯減少,GPS 5μmol/L組差異無統計學意義。

圖2 GPS對NSCLC細胞炎癥因子分泌的影響Figure 2 Effect of GPS on the secretion of inflammatory factors in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖3 GPS對NSCLC細胞中NF?κB P65磷酸化的影響Figure 3 Effect of GPS on NF?κB P65 phosphorylation in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖4 GPS對NSCLC細胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of GPS on the invasion ability of non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖5 GPS對NSCLC細胞EMT標記物蛋白表達的影響Figure 5 Effect of GPS on the expression of EMT marker protein in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

3 討論

肺癌的侵襲和轉移是導致癌癥治療失敗和晚期NSCLC預后不良的主要因素,也是其高死亡率的原因[12?13]。因此,發現新的抗轉移劑對于肺癌的治療至關重要。最近,大量證據表明許多基于天然產物的藥物因其對多種疾病,特別是對腫瘤轉移的有益作用而受到了更多關注。GPS是一種重要的植物次生代謝產物,已顯示出抗癌作用[10?11,14]。CCK8實驗表明,與對照比較,GPS10μmol/L及以上濃度時,A549細胞的存活率顯著降低,所以GPS對A549細胞具有毒性作用。

研究發現,炎癥微環境能通過多種細胞因子來促進腫瘤的發生、發展,參與腫瘤的轉移等[15?16]。IL?6是誘導上皮間質轉化(epithelial?to?mesenchymal transition,EMT)和NSCLC腫瘤轉移的重要細胞因子[17?18]。IL?6的增加可導致肺癌分子靶向治療的耐藥性[19],IL?6水平可能是NSCLC患者的預后指標[20]。IL?1β在腫瘤微環境中起著雙向作用,微量IL?1β可促發適當的免疫應答而激活特異性免疫反應而起免疫監控效應,大量IL?1β可能導致炎性損傷[21]。本研究結果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明顯降低A549細胞中IL?6、IL?1β和iNOS的產生,減輕腫瘤微環境的炎癥浸潤。iNOS被認為與NSCLC的發生明顯相關,研究發現NSCLC患者腫瘤組織中iNOS的表達顯著增高,且與術后生存期及淋巴結轉移密切相關[22]。NF?κB被認為是免疫和炎癥反應的主要介質,且IL?6可能會增強NF?κB信號通路的激活[23]。本研究結果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)明顯降低NF?κB P65的磷酸化水平,抑制NF?κB通路的激活。

EMT被認為是癌癥惡性、轉移和復發中最關鍵的步驟之一[24]。為了進一步檢測GPS的潛在抗轉移作用,對A549細胞進行了侵襲實驗和EMT蛋白表達的檢測。在EMT進展過程中,癌細胞會獲得間質特征,例如波形蛋白和N?鈣黏著蛋白的增加,并失去上皮特性,例如E?鈣黏著蛋白的減少[25]。本研究中,GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明顯減少A549細胞的侵襲數目,并通過降低N?鈣粘蛋白和波形蛋白的表達來顯著抑制EMT進展,同時增加E?鈣粘蛋白的蛋白表達,這表明GPS抑制了A549細胞的EMT。

綜上所述,本研究結果表明GPS可以有效抑制A549細胞的侵襲和轉移,其主要機制可能是炎癥因子IL?6和NF?κB P65的磷酸化水平降低所致。因此,GPS可能會成為將來治療或預防肺癌的有效抗腫瘤藥物。