牡荊葡基黃酮對肺癌細胞惡性生物學行為及腫瘤生長的影響

陳鴻運，李曉明，黃國勝，楊金華，喬飛

（南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普胸外科，河南南陽473000）

肺癌細胞侵襲和轉移是肺癌形成的直接原因，在肺癌細胞轉移過程中微管形成和間質細胞的增加會導致細胞形態、細胞內物質轉移、細胞內信號轉導等過程異常并最終形成肺癌[1]。目前，臨床上肺癌的治療方法主要有放化療和手術切除，但治療效果都不理想，且具有副作用。牡荊葡基黃酮（Vitexin）是一種芹菜素黃酮苷，主要存在于食用植物和藥用植物中。研究表明，牡荊葡基黃酮通過抗氧化、抗炎癥、抗癌、神經保護等生物活性在多種疾病及腫瘤預防中發揮重要調控作用[2?5]。Liu等[6]研究發現，牡荊葡基黃酮給藥處理肺癌A549細胞會誘導細胞凋亡。趙培等[7]發現，牡荊葡基黃酮能抑制肺癌A549細胞侵襲和遷移，促進細胞凋亡。因此，本研究選擇不同劑量牡荊葡基黃酮處理肺癌A549細胞，觀察肺癌細胞侵襲和遷移，微管形成和間質轉化，同時，利用裸鼠成瘤體內實驗驗證牡荊葡基黃酮給藥治療效果，探討牡荊葡基黃酮在肺癌細胞中的調控作用，為牡荊葡基黃酮在肺癌中的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 細胞、試劑和儀器 牡荊葡基黃酮（質量分數≥98%）購自成都植標化純生物技術有限公司；人肺癌A549細胞株由四川大學華西醫院再生醫學研究中心/衛生部移植工程和移植免疫重點實驗室提供，將細胞放置在含10%（φ）胎牛血清（fetal bovine se?rum，FBS）、0.1 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培養液中，于37℃、5%（φ）CO2培養箱中培養；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清和DMEM培養基購自美國Giboc公司；E?cadherin、N?cadherin抗體、免疫組化檢測試劑盒PV?6000和DAB顯色液均購自福州邁新生物技術開發有限公司；Anti?Fibronectin Rabbit pAb購自武漢塞維爾生物技術有限公司；RT?6100酶標儀（Rayto）；D3024R臺式高速離心機（DRAGONLAB）；MS?PB磁力攪拌器（Servicebio）；TSY?B脫色搖床（Servicebio）；BV?2電泳儀（Servicebio）；V370掃描儀（EPSON）；KE0003087移液槍（Dragon）；E100顯微鏡（Nikon）；Nikon DS?U3成像系統（日本尼康）。

1.1.2 實驗動物 20只雄性SPF級Balb/c裸鼠，4～6周齡，體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2017?0022。動物飼養條件：每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格、規范的卡片登記管理，24℃條件下獨立飼養，建模前24 h小鼠禁食不禁水。

1.1.3 動物分組、建模及給藥 將20只雄性Balb/c裸鼠隨機分為對照組和給藥組（n=10），將生長至對數期的肺癌A549細胞配制成2×105個/mL濃度的細胞懸浮液，取200μL細胞懸浮液接種到裸鼠皮下，建立移植瘤裸鼠模型，參照文獻[8]給藥組腹腔注射0.1 mL生理鹽水（含Vitexin 2 mg/kg），對照組同時注射等量的生理鹽水，持續4周。觀察腫瘤體積，每5天用直尺測量1次腫瘤體積（體積=0.52×最長直徑×最長橫徑），培養30 d后檢測腫瘤質量。

1.2 方法

1.2.1 CCK8篩選Vitexin劑量 培養肺癌A549細胞株，待細胞90%融合后，用不同濃度的Vitexin處理細胞24 h后，將細胞鋪入96孔板，每個濃度設置5個復孔，放入5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養24 h。24 h后將配好的CCK8溶液按每孔10μL加入，37℃恒溫箱內避光繼續培養2～4 h，最后將96孔板放入酶標儀，450 nm處測定吸光度（A）值。

1.2.2 Transwell檢測肺癌A549細胞侵襲能力 將不同濃度Vitexin處理的肺癌A549細胞株進行細胞轉染24 h后，胰酶消化、離心并重懸細胞。基質膠和無血清培養基按1∶8（V:V）的比例混合均勻，加入transwell細胞小室中，小室上室加入不含胎牛血清的DMEM培養基，基質膠底層加入完全培養基，將細胞置于上室中培養30 min使其處于饑餓狀態，然后將細胞小室置于37℃恒溫箱中培養1 h。Tran?swell小室接種肺癌細胞（3×104/孔）檢測細胞侵襲能力。24 h后取出細胞小室，多聚甲醛固定60 min后用結晶紫染色20 min，隨機選取5～10個視野用顯微鏡拍照并計數。

1.2.3劃痕實驗檢測肺癌A549細胞遷移能力 使用6孔板接種適量對數生長期的肺癌細胞，調整細胞密度至1×106個/孔，將6孔板放入培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，用不同濃度的Vitexin處理肺癌A549細胞24 h。24 h后去掉培養基用牙簽在孔內均勻地劃痕，加入無血清培養基進行培養并于劃痕后0 h和24 h在同一位置觀察拍照，分析細胞遷移距離。

1.2.4 成管實驗檢測肺癌A549細胞微管形成能力 實驗前先將96孔板和槍頭預冷，然后將50μL Matrigel加入96孔板中，放入37℃孵箱中0.5 h。用胰酶消化各組肺癌細胞并用ECM培養基重懸，以2×106個細胞種入96孔板中，12 h后顯微鏡下觀察拍照，使用Image J計算分析微管結節數目。

1.2.5 Western blot檢測E?cadherin、N?cadherin和FN表達水平 使用胰酶消化細胞，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。10%SDS?PAGE分離蛋白并轉移至PVDF膜上，然后加入5%的脫脂牛奶室溫封閉120 min。待封閉完成后，棄掉封閉液，加入一抗于4℃下封閉過夜。次日滴加二抗室溫封閉60 min，最后加入ECL顯色液曝光顯影。獨立重復實驗3次，取平均值。

1.2.6 免疫組化檢測E?cadherin和N?cadherin表達水平 按Envision二步法和免疫組化檢測試劑盒（PV?6000）說明操作，將石蠟切片脫蠟至水，室溫孵育5～10 min，用檸檬酸抗原修復緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，切片放入3%H2O2溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內源性過氧化物酶，BSA封閉30 min，加入一抗孵育過夜，加二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復染。用PBS代替一抗作陰性對照。蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出來的陽性信號為棕黃色。

1.3 統計學分析

使用SPSS17.0軟件分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）。多組數據比較采用方差分析，兩兩比較采用L S D法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK8篩選Vitexin劑量

用不同劑量Vitexin處理肺癌A549細胞株24 h，CCK8篩選合適的Vitexin劑量（圖1）。不同濃度Vitexin濃度處理后，各組的細胞活力見圖1。25μmol/L Vitexin處理后，細胞活力開始下降，50 μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后細胞活力顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05），200μmol/L和400μmol/L Vitexin處理后細胞活力極低，太高濃度的Viteixin對細胞活力會產生強抑制性，導致無法觀測影響作用，因此，50μmol/L和100μmol/L Vitexin為最佳藥物觀測劑量。

圖1 CCK8篩選合適的Vitexin劑量Figure 1 CCK8 screening the appropriate dose of Vitexin

2.2 Vitexin對肺癌A549細胞侵襲能力的影響

Transwell檢測肺癌A549細胞侵襲數目，結果如圖2所示，同一視野下各組侵襲細胞數目分別為Vitexin 0μmol/L（102±14）、25μmol/L（93±18）、50μmol/L（38±7）、100μmol/L（18±9）個。與Vitexin 0μmol/L組相比，25μmol/L Vitexin對肺癌A549細胞的侵襲沒有明顯抑制作用（P＞0.05），經50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，肺癌A549細胞侵襲數量差異有統計學意義（P＜0.05）。結果說明Vitexin對肺癌A549細胞侵襲具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.3 Vitexin對肺癌A549細胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測肺癌A549細胞株遷移能力，與處理0 h相比，Vitexin處理24 h后各組均有明顯的遷移，見圖3A。24 h后細胞遷移率（%）分別為Vitexin 0μmol/L（78±7）、25μmol/L（74±8）、50μmol/L（57±6）、100μmol/L（35±9）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin 25μmol/L組的遷移率差異不明顯（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，肺癌細胞遷移率顯著下降，且差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。結果表明，Vitexin對肺癌細胞的遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.4 Vitexin對肺癌A549細胞微管形成的影響

成管實驗檢測肺癌A549細胞微管數目變化，結果如圖4所示，各組微管節點數分別為Vitexin

0μmol/L（84±7）、25μmol/L（78±9）、50μmol/L（43±10）、100μmol/L（26±6）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin25μmol/L組微管節點數無明顯差異（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，A549細胞微管數目顯著減少，且差異有統計學意義（P＜0.05）。結果說明Vitexin抑制肺癌細胞微管形成，且呈劑量依賴性。

圖2 Transwell檢測肺癌A549細胞侵襲能力Figure 2 Detection of invasive ability of lung cancer A549 cells by Transwell

圖3 劃痕實驗檢測肺癌A549細胞遷移率Figure 3 Detection of the migration rate of lung cancer A549 cells by scratch test

圖4 肺癌A549細胞株成管檢測Figure 4 Tube formation of lung cancer A549 cells

2.5 Vitexin對 肺 癌A549細 胞E?cadherin、N?cad?herin、FN表達水平的影響

Western blot檢測E?cadherin、N?cadherin和纖維黏蛋白的表達，結果如圖5所示，各組E?cadherin蛋白表達水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.06±0.03）、25μmol/L（0.07±0.04）、50μmol/L（0.24±0.07）、100 μmol/L（0.88±0.09），N?cadherin蛋白表達水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.54±0.08）、25μmol/L（0.52±0.06）、50μmol/L（0.18±0.05）、100μmol/L（0.03±0.01），FN蛋白表達水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.58±0.05）、25μmol/L（0.54±0.07）、50μmol/L（0.17±0.03）、100μmol/L（0.05±0.04）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin 25μmol/L組E?cadherin、N?cadherin、FN蛋白表達水平差異均無明顯差異。50μmol/L和100μmol/LVitexin給藥處理后，E?cadherin、N?cad?herin、FN蛋白表達水平差異顯著，且差異有統計學意義（P＜0.05）。結果說明，Vitexin通過調節E?cad?herin、N?cadherin和FN蛋白表達抑制肺癌A549細胞間質轉化。

2.6 Vitexin對腫瘤生長的影響

裸鼠成瘤體內實驗檢測Vitexin給藥治療效果，腫瘤體積變化如圖6A所示。直尺測量30 d內腫瘤體積（5 d/次），結果如圖6B所示，未給藥組腫瘤體積（V/mm3）分別為25±9、68±15、215±65、518±84、1165±254、2314±387，Vitexin 2 mg/kg組腫瘤體積（V/mm3）分別為15±7、32±9、78±36、198±64、426±117、925±176。30 d后稱取腫瘤質量，結果如圖6C所示，未給藥組腫瘤質量為（0.40±0.07）g，Vitexin 2 mg/kg組腫瘤質量為（0.15±0.05）g。與未給藥組相比，2 mg/kg Vitexin給藥治療后，腫瘤體積明顯變小，質量明顯下降，且差異有統計學意義（P＜0.05）。利用免疫組化檢測裸鼠中E?cadherin和N?cadherin陽性細胞率，結果如圖6D所示，E?cadherin陽性細胞率(%)分別為7±5、28±8，N?cadherin陽性細胞率分別為57±9、11±6。與未給藥組相比，Vitexin 2 mg/kg顯著增加E?cadherin陽性細胞率，減少N?cadherin陽性細胞率，且差異具有統計學意義（P＜0.05），結果說明Vitexin抑制腫瘤生長及間質轉換。

3 討論

牡荊葡基黃酮作為傳統中藥，具有天然無毒副作用、藥效佳等特點，常用于心血管等疾病中，已有研究報道，牡荊葡基黃酮在腫瘤及癌癥中具有調控效果[9?10]。本研究旨在探索牡荊葡基黃酮對肺癌細胞的侵襲和遷移、微管形成、間質轉換及腫瘤生長的影響作用，為肺癌診斷與治療提供新的藥物。本研究結果顯示，經中高濃度牡荊葡基黃酮處理后，肺癌細胞活力明顯降低，與趙蓓等[7]的研究結果相符，結果提示牡荊葡基黃酮在肺癌細胞中具有調控作用。

圖5 Westerrn blot檢測E?cadherin、N?cadherin和FN蛋白表達水平Figure 5 Expression of E?cadherin,N?cadherin and FN protein by western blot

腫瘤細胞侵襲和遷移是腫瘤擴散及轉移的前提條件，腫瘤細胞侵襲是指腫瘤細胞通過其分泌的酶類物質突破附近細胞的外基質，入侵周圍組織細胞，達到侵襲的目的。而腫瘤遷移是指腫瘤細胞依靠其運動及形變能力從一個組織或部位向另一個組織或部位移動的過程[11]。本研究結果發現，50、100μmol/L牡荊葡基黃酮能顯著抑制肺癌細胞侵襲和遷移能力，且呈劑量依賴性。結果提示，牡荊葡基黃酮通過抑制肺癌細胞侵襲和遷移降低肺癌細胞活力。

圖6 Vitexin對肺癌生長和EMT的影響Figure 6 Effect of Vitexin on lung cancer cell growth and EMT

微管是由微管蛋白和輔助蛋白組成的中空管狀結構，在細胞分裂、細胞形態、物質運輸及信號轉導等過程中發揮重要作用。Yang等[12]研究發現，在肺癌細胞增殖過程中，微管通過聚合為紡錘體促進腫瘤細胞有絲分裂過程，同時，促進肺癌細胞侵襲和轉移。Zheng等[13]也指出，微管介導并抑制自噬溶酶體的形成阻遏非小細胞肺癌細胞的侵襲。本研究結果顯示，經牡荊葡基黃酮處理后，肺癌細胞微管數量明顯減少，結果進一步說明牡荊葡基黃酮通過降低微管形成抑制肺癌細胞侵襲和遷移。

間質轉換是上皮細胞向間質細胞轉換的過程，上皮細胞結構穩定，胞間連接緊密且具有較強的細胞極性，而間質細胞則與之相反，胞間結構疏松，缺乏細胞極性，具有極強的侵襲和轉移能力[14]。E?cadherin是上皮細胞緊密連接和穩定結構的重要調節蛋白，在上皮組織中往往高表達，同時抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[15]。N?cadherin和FN則與之相反，兩者能夠降低細胞間的黏附性，提高腫瘤細胞的運動能力，促進腫瘤細胞侵襲和遠處轉移[16?17]。研究發現，上調E?cadherin蛋白表達，下調N?cadherin蛋白表達能有效抑制間質轉換過程[18?19]。吳安邦等[20]通過實驗證實在非小細胞肺癌細胞中E?cadherin高表達，N?cadherin低表達。本實驗結果顯示，牡荊葡基黃酮下調N?cadherin和FN蛋白表達，上調E?cad?herin蛋白表達，且呈劑量依賴性。結果提示，牡荊葡基黃酮通過調節E?cadherin和N?cadherin蛋白表達抑制肺癌細胞間質轉換過程和侵襲轉移。

已有研究表明，牡基葡基黃酮對肺癌細胞惡性生物學行為具有抑制作用[6?7]，但牡荊葡基黃酮對腫瘤生長的影響及給藥治療效果未見報道，因此，本研究前期工作主要檢測牡荊葡基黃酮在肺癌細胞侵襲遷移、微管形成和間質轉換中的調控作用，為進一步明確牡荊葡基黃酮在肺癌中的藥理作用，本研究利用裸鼠成瘤體內實驗觀測牡荊葡基黃酮對腫瘤生長的影響。結果顯示，牡荊葡基黃酮給藥治療后顯著抑制成瘤裸鼠腫瘤生長，同時抑制N?cadherin蛋白表達，上調E?cadherin表達。結果提示，牡荊葡基黃酮可作為肺癌診斷和治療的潛在藥物。

綜上所述，牡荊葡基黃酮在肺癌細胞侵襲和遷移、微管形成、間質轉換和腫瘤生長中具有抑制作用，但具體的抑制作用機制有待進一步研究。后續實驗計劃探究牡荊葡基黃酮在肺癌細胞中的作用機制，為牡荊葡基黃酮的臨床應用提供更完善的實驗基礎。