放線菌對釀酒微生物調控的初步解析

施 思，張 霞，楊康卓，廖勤儉，喬宗偉，2，鄭 佳，劉多濤

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644007）

白酒釀造是一項生物工程，特定白酒產區會在長期的馴化過程中孕育出一個較為穩定的“微生物圈”，而這個“微生物圈”與白酒釀造的整個過程密切相關。因此，白酒微生物的研究歷來都是重要的討論課題。在這個圈子里，細菌、酵母和霉菌是優勢菌，大量的研究也主要集中于這些菌群在各個釀造區系中的分離鑒定、功能性物質分析和相關應用等方面[1-4]。在傳統白酒釀造微生態的研究中，放線菌數量較少，對于這類菌群的研究并不充分，目前少量的生物調節機理闡釋也主要集中在醬香和清香型白酒釀造環境中[5-6]。眾所周知，放線菌具有產生大量次級代謝產物的能力，極強的生物調控作用，在生物醫藥領域中放線菌的研究已相對成熟。鑒于放線菌強大的生物調控能力，很有必要繼續發掘其在獨特的釀造環境中對發酵過程的生物調節作用及價值。

本研究立足五糧液特有的釀造資源，將已獲得的放線菌株在實驗室條件下充分發酵，以獲得大量的代謝產物。通過純菌株復配液態發酵試驗探索放線菌在代謝調控方面的潛力；從新的角度來進一步揭示濃香型白酒的發酵機理，為白酒品質提升提供更多的基礎理論和技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株來源

實驗室保存菌株：鏈霉菌Streptomyces sp.JP12（分離于窖皮泥，氣生菌絲為長鏈彎曲）、鏈霉菌Streptomyces sp.RZ1（分離于糟醅，氣生菌絲為初級松環）、小單胞菌Micromonospora sp.JD3（分離于窖底泥）；釀酒酵母S.cerevisiaeJ7 和芽孢桿菌Bacillus sp.X6均分離于糟醅。

1.1.2 試劑

菌株復配液態共酵培養基成分為（參考糧食中碳氮質量比約為6.5∶1）[7]：葡萄糖17.5 g/L，細菌學蛋白胨2.7 g/L，氯化鈉0.5 g/L。培養基相關試劑均為國產分析純，色譜分析相關試劑均為進口色譜純。

1.1.3 設備與儀器

離心機（5810），德國Eppendorf 公司；pH 計（inoLabpH740），德國WTW；生化培養箱（LRH）、恒溫振蕩器（THZ-98C），上海一恒科技；頂空固相微萃取（CAR/DVB/PDMS 纖維萃取，50 μm），美國Supelco 公司；氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，7890B-5977B），高效液相色譜儀（1100），美國Agilent公司；色譜柱（Venusil ASB C184.6 mm×250 mm，5 μm），天津博納艾杰爾公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌發酵物的提取

將放線菌培養物置于28 ℃搖床，120 r/min，培養5 d 獲取發酵液；發酵液12000 r/min 離心15 min取上清液；上清液經0.2 μm 微孔濾膜過濾，收集得到本試驗所用發酵產物。

1.2.2 發酵力測定

發酵力：1 mL 酵母菌液發酵72 h 利用蔗糖產生二氧化碳的毫升數，即mL/(mL·72 h)，底物為8 %的蔗糖溶液。本試驗采用的發酵溫度為28 ℃和33 ℃，試驗組添加1 mL 酵母菌液和1 mL 放線菌發酵產物，以不添加放線菌發酵產物的純酵母發酵液為對照組，其他溶液配制參數不變[8]。

1.2.3 菌株復配液態共酵

1.2.3.1 芽孢桿菌與放線菌復配發酵

試驗組培養基中添加2 %的細菌X6 種子液和2 %的放線菌發酵產物，以不添加放線菌發酵產物的純細菌培養液為對照組，置于33 ℃靜止培養5 d。發酵結束后，測pH值，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集5 mL過濾液供有機酸檢測備用。

1.2.3.2 釀酒酵母與放線菌復配發酵

試驗組培養基中添加2 %的酵母J7 種子液和2%的放線菌發酵產物，以不添加放線菌發酵產物的純酵母培養液為對照組。將其中一組用乳酸調節pH5.5，置于28 ℃靜止培養5 d；另一組用乳酸調節pH4.5，置于33 ℃靜止培養5 d。發酵結束后，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，收集1 mL 過濾液供揮發性香氣物質檢測備用。

1.2.4 色譜分析

有機酸含量檢測采用HPLC法測定[9]，標準曲線為：y=0.284x-3.0446，R2=0.9999。揮發性香氣物質檢測采用頂空固相微萃取-氣質聯用法測定[10]。

1.2.5 代謝物路徑分析

為進一步闡釋放線菌調控產生的代謝物差異的生物學意義，使用MetaboAnalyst4.0 中路徑分析模塊，將相應的代謝物分別富集到釀酒酵母和芽孢桿菌的代謝途徑上，使用超幾何分布法計算，解析其調控路徑。

2 結果與分析

2.1 發酵力檢測

酵母與不同放線菌發酵產物在28 ℃和33 ℃共酵時發酵力的變化情況結果如圖1所示。

由圖1 可知，與對照組相比，3 組放線菌發酵產物具有程度不同地促進發酵作用。在不同溫度下，鏈霉菌JP12 發酵產物均能極大提升釀酒酵母J7 的發酵水平。

圖1 不同組別發酵力檢測結果

2.2 發酵液pH值變化及有機酸檢測

將實驗室保存的1 株產酸的芽孢桿菌X6 與放線菌產物進行復配發酵，初始pH 6.95，33 ℃靜止培養5 d 后，各發酵組pH 值變化情況分別為：對照組5.4、JP12 組5.74、JD3 組5.29，RZ1 組5.86。初步判斷，JP12 和RZ1 組產物具有抑制產酸的趨勢。通過對發酵液中四大酸的分析表明，JP12 和RZ1 組產物對細菌的產酸調控主要是抑制了乳酸的代謝，與此同時激活了少量己酸的生成。發酵液中四大酸的分析結果見表1。

2.3 揮發性香氣物質檢測

揮發性香味物質對于白酒的感官評價具有重要影響，本試驗檢測了低溫低酸A 組（28 ℃、pH5.5）和高溫高酸B組（33 ℃、pH4.5）發酵情況下，揮發性物質的代謝情況，如表2所示。

由表2 可知，3 株放線菌對各香味物質生成的影響程度不一。如異丁醇在低溫低酸的發酵條件下，3 組試驗組與空白組相比，產量分別提高了238.9%、225%和249%；而在高溫高酸的發酵條件下，試驗組中的異丁醇與對照組相比產量偏低，影響不顯著。在己酸乙酯的生成影響中，JP12 和JD3試驗組在兩種發酵條件下都能促進己酸乙酯的生成，尤其是JP12 組在33℃、pH4.5 的試驗條件下，將己酸乙酯的含量提高了669.4%。苯乙醇一般認為是具有玫瑰香的一類風味物質[11-12]，試驗結果顯示，3 株放線菌產物復配試驗組中，苯乙醇的含量在兩種發酵條件下都顯著升高。從苯乙醛的檢測結果來看，初步推測是放線菌的發酵產物促進了苯乙醛的還原反應生成了苯乙醇，同時通過酯化作用生成了乙酸苯乙酯。從綜合指標來看，菌株JP12 具有生產應用的潛能。

表1 發酵液中四大酸的分析結果 (mg/L)

2.4 代謝路徑分析

為了探索放線菌產物在復配發酵中潛在的代謝調控途徑，試驗使用MetaboAnalyst4.0 對相關的代謝途徑進行解析。上述試驗結果顯示，放線菌發酵產物具有降乳增己以及促進蔗糖代謝和生成苯乙醇的調控潛能，研究將乳酸、己酸、蔗糖、苯乙醛、苯乙醇分別富集到對應的芽孢桿菌及釀酒酵母的代謝途徑，得到途徑分析圖見圖2。

表2 揮發性香氣物質檢測結果 (μg/L)

圖2 代謝途徑分析

圖2 芽孢桿菌代謝通路分析結果顯示共獲得6條途徑，基于影響值大于0.01 對關鍵代謝途徑進行篩選[13]，結果發現有3 條關鍵代謝途徑分別是丙酮酸代謝、硫代謝和糖酵解途徑。在模塊中點擊途徑圖中的相應圓圈，可以得到途徑解析：在糖酵解途徑中葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖，再經果糖-6-磷酸激酶-1、醛縮酶、磷酸丙酮異構酶、丙酮酸激酶等酶作用下生成丙酮酸；在硫代謝中，硫酸鹽等物質通過生成甲磺酸、L-同型半胱氨酸、O-乙酰基-L-絲氨酸、L-高蘇氨酸等物質，并最終代謝生成烷磺鹽酸、亞硫酸鹽、半胱氨酸、乙酸鹽和琥珀酸酯；在芽孢桿菌的丙酮酸代謝途徑中，并無乙醇的生成，主要涉及乙醛代謝，生成乳酸、乙酸鹽、丙酮酸、草酰乙酸及乙酰輔酶A 等代謝產物。這3 條代謝途徑中影響值較高的物質為乙酸鹽和乳酸。

圖2 釀酒酵母代謝途徑分析結果顯示共獲得3條途徑，這3 條關鍵代謝途徑分別是苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝及半乳糖代謝，其影響值依次為0.4、0.05669 和0.02564。在苯丙氨酸代謝途徑中，苯乙醛影響值最高，由苯丙酮酸代謝生成；在半乳糖代謝中，蔗糖分別生成D-葡萄糖和D-果糖；在淀粉和蔗糖代謝中，淀粉與蔗糖的最終代謝物為D-葡萄糖。

3 討論

放線菌是產生次生代謝產物最多的微生物，且大多具有生物調控作用。在實驗過程中，相關放線菌產物并未對酵母和芽孢桿菌的生長繁殖產生破壞，只是對相關的代謝途徑進行了不同的調控，如促進酵母蔗糖代謝、“控乳增己”和增強己酸乙酯、苯乙醇等風味物質。通過對放線菌生物調控的研究，可以將其中合理的調控應用到生產工藝的改善，同時通過對其代謝途徑的解析，可以得到一些關鍵的中間代謝物，以便為進一步完善發酵機理提供更多的研究選擇。研究也將在下一步對相關放線菌的代謝產物進行分離鑒定，為精準調控提供更多的可能。