固相萃取-HPLC法同時測定大米中甲萘威和阿特拉津

朱小亮，許亞南，吳到懋，孫步旭，樊冬玲*

江蘇省宿遷環境監測中心（宿遷 223800）

阿特拉津又名莠去津，是一種成本低廉、除草效果好、使用廣泛的三嗪類除草劑[1]，其半衰期長，在土壤中積聚不易分解，極易對地下水造成污染，對生物的肝臟、腎臟、心肺和再生繁殖產生損傷[2-3]，甚至引發癌癥，位列聯合國27種持久性有毒污染物之一[4]。甲萘威又名西維因，是一種廣泛應用的氨基甲酸酯類廣譜殺蟲劑，性質穩定不易分解，對生物體具有高毒性，如肌肉顫動、流淚、瞳孔縮小等乙酰膽堿酯酶抑制癥狀，甚至致癌[5]。因此，應對食品中甲萘威和阿特拉津進行有效監測。

隨著檢測技術發展，較多的檢測方法被報道。主要檢測方法有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-11]、高效液相色譜-質譜法[12-14]、超高效液相色譜-串聯質譜法[15-18]。但方法主要是采用氣質聯用技術或液質聯用技術，對試驗設備要求較高，檢測成本昂貴，對監測人員要求高，不適合推廣。試驗建立固相萃取-高效液相色譜二極管陣列檢測器（DAD）法同時測定大米中甲萘威和阿特拉津的方法。大米經乙腈提取、C18Cartridges柱萃取凈化、濃縮，用甲醇定容至2 mL直接測定，樣品前處理操作簡捷、靈敏度高、方法穩定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），配備二極管陣列檢測器（DAD）、色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；RAPid VAP?樣品快速濃縮儀（美國Labconco）；康銘超純水機UPC-20UV（北京康銘時代公司）；EYELA萃取振蕩儀MMV-1000W（東京理化器械株式會社）。

甲萘威標準溶液、阿特拉津標準溶液（質量濃度均為100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所）；甲醇、二氯甲烷、乙腈、石油醚、正己烷（均為色譜級，德國Merck公司）；無水硫酸鈉、氯化鈉（高級純，國藥試劑）；自制高純水。

1.2 標準曲線的繪制

按照逐級稀釋的方式配制標準濃度點，先將甲萘威（100 μg/mL）和阿特拉津（100 μg/mL）標準溶液稀釋為質量濃度20 μg/mL混合標準使用液，充分搖均備用。將甲萘威和阿特拉津標準使用液用甲醇稀釋為0，0.02，0.20，0.40，0.60，1.00和2.00 μg/mL這7個質量濃度，按照儀器優化條件進行測定，分別以甲萘威和阿特拉津的峰面積對質量濃度繪制標準曲線。

1.3 前處理方法

準確稱取5.00 g經粉碎的大米，置于50 mL離心管中，向其中加入25 mL乙腈溶液，浸泡24 h后，將離心管置于振蕩儀上充分振蕩萃取30 min，靜置10 min后，以5 000 r/min離心5 min，轉移上清液于濃縮瓶中，濃縮后加入3 mL甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）混勻，待凈化。將C18Cartridges用5 mL甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）活化后上樣，再用甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）洗脫液洗脫5次，洗脫液通過氮吹濃縮儀濃縮至近干，用甲醇定容至2 mL，混勻，過0.45 μ m濾膜后入2 mL的色譜瓶中，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱Eclipse XDB-C18反向柱（4.6 mm×200 mm，5 μ m）；流動相采用甲醇-水（60∶40，V/V），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃；二極管陣列檢測器（DAD）波長220 nm；進樣量5.0 μL。

2 結果與分析

2.1 萃取試劑選擇

考察4種常用的農藥類有機萃取試劑（正己烷、乙腈、甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）、石油醚）對甲萘威和阿特拉津的提取效率，樣品加標回收率試驗，重復測定6次，并通過平均回收率高低來選擇萃取試劑，見表1。結果表明，乙腈對甲萘威的回收率為91.3%，明顯優于其他；正己烷、乙腈、甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）對阿特拉津的回收率均較高，優于石油醚；綜合分析乙腈對大米中甲萘威和阿特拉津的提取效率均大于90%，提取效果較好，故試驗采取乙腈為甲萘威和阿特拉津的萃取試劑。

2.2 色譜特性

將質量濃度均為1.5 μ g/mL甲萘威和阿特拉津混合標準溶液，流動相采用甲醇-水（60∶40，V/V），流速0.4 mL/min，按照測試方法通過液相色譜分析，標準色譜圖見圖1，典型樣品色譜圖見圖2。由圖1知，甲萘威與阿特拉津在色譜圖上出現明顯2個峰，分離完全，無拖尾現象，峰肩對稱尖銳，基線平穩，可用于甲萘威與阿特拉津的定量分析。

表1 4種提取劑的回收率

圖1 甲萘威和阿特拉津標準色譜圖

圖2 典型陽性樣品色譜圖

2.3 分析波長的選擇

使用二極管陣列檢測器（DAD）對質量濃度為1.5 μg/mL甲萘威和阿特拉津標準溶液分別進行全波段（190～400 nm）掃描，以選擇最佳檢測波長，掃描譜圖見圖3。甲萘威在220 nm與280 nm處有2個吸收峰，其中在220 nm處的吸收強度較強；阿特拉津在220 nm與260 nm處有2個吸收峰，其中在220 nm處的吸收峰較強，發現2種物質在220 nm均有較強吸收峰，且無干擾峰，故選擇220 nm作為同時測定甲萘威和阿特拉津最佳吸收波長。

2.4 流動相分流比選擇

試驗以甲醇-水（60∶40，V/V）和乙腈-水（60∶40，V/V）2種體系作為流動相進行分離效果試驗。結果發現2種流動相體系均能對甲萘威和阿特拉津進行分離，但基于乙腈成本高、有毒，同時甲醇具有柱壓低、分離快、峰對稱尖銳的優勢，故試驗選擇甲醇-水為流動相。同時設置不同體積比（80∶20，70∶30，60∶40，V/V）的甲醇-水流動相分別試驗，結果見圖4。甲醇-水體積比80∶20時，甲萘威和阿特拉津出峰較快，雖然2種化合物得到分離，但存在底液峰重疊干擾，無法排除；甲醇-水體積比70∶30時，同樣存在底液峰干擾，且甲萘威峰肩不對稱；甲醇-水體積比60∶40時，甲萘威與阿特拉津完全分離，出峰時間分別為3.81和5.11 min。隨著甲醇體積減少，2種化合物分離效果變好，但發現峰形變寬，保留時間延長。綜合分析后，試驗選擇甲醇-水（60∶40，V/V）作為流動相。

圖3 甲萘威和阿特拉津紫外波長掃描圖

圖4 不同體積比流動相試驗

2.5 流動相流速和柱溫

在甲萘威和阿特拉津質量濃度均為1.5 μg/mL、甲醇-水（60∶40，V/V）流動相下，對0.4，0.8和1.0 mL/min 3種流動相流速進行分離效果試驗，色譜圖見圖5。隨著流速增加，2種化合物的分離效果變差；流速0.4 mL/min時，甲萘威和阿特拉津分離完全，峰形對稱，底液無干擾，且測定時間適當，故試驗選擇流動相流速0.4 mL/min。對20，30和40 ℃ 3種色譜柱柱溫進行比對試驗，結果差別不大，保留時間隨柱溫升高僅稍有縮短，因而選擇柱溫40 ℃。

圖5 不同流動相流速下試驗

2.6 線性關系及檢出限

在最佳試驗條件下，按照逐級稀釋的方式，分別配制質量濃度為0，0.02，0.20，0.40，0.60，1.00和2.00 μg/mL甲萘威和阿特拉津標準混合溶液，按照檢測方法通過高效液相色譜進行測定，色譜圖見圖6。甲萘威與阿特拉津分離完全，質量濃度與峰面積呈較好的線性關系。結果表明，在0～2.0 μ g/mL范圍內均呈現良好線性相關性，見圖7，甲萘威曲線方程為y=377.405 3x+4.064 5，相關系數R2=1.000；阿特拉津曲線方程為y=178.245 1x+2.113 4，相關系數為R2=1.000。試驗以3倍信噪比來確定最低檢出限，10倍信噪比確定定量限，該測定方法甲萘威和阿特拉津檢出限分別為1.0和3.0 μ g/kg，定量限分別為3.3和10 μ g/kg。

圖6 不同濃度下甲萘威與阿特拉津色譜圖

圖7 甲萘威和阿特拉津的線性方程

2.7 準確度和精密度試驗

在最佳檢測條件下，分別量取100 mL空白水樣，并加入甲萘威和阿特拉津混合標準樣品，濃度均為0.2，0.4和0.8 mg/kg，按照試驗檢測方法進行萃取、除水、濃縮、凈化，定容后進行測定，每種濃度重復測定6次，分別計算樣品的加標回收率和相對標準偏差（δRSD）。結果發現在低、中、高3種不同濃度下，甲萘威和阿特拉津回收率分別為88.3%～102.2%和87.5%～104.3%，相對標準偏差（δRSD，n=6）分別為1.2%～3.3%和2.3%～4.7%，具體見表2。結果表明該檢測方法具有較高準確度和精密度，可用于大米中甲萘威和阿特拉津的定量測定。

表2 精密度和準確度試驗（n=6）

2.8 樣品測定

在最佳檢測條件下，采購于市場中3個廠家大米，按照檢測方法進行提取、凈化、濃縮，定容后進行測定，同時進行加標回收率試驗，結果見表3。結果發現，3個樣品均未檢出甲萘威及阿特拉津。通過10 μg加標量模擬實際樣品。結果發現水樣中甲萘威和阿特拉津回收率較好，甲萘威和阿特拉津的回收率分別為95.4%～102.3%和94.6%～104.2%，表明該方法可用于大米中甲萘威和阿特拉津測定。

表3 3種大米實際樣分析及加標回收率

3 結論

通過優化色譜工作條件，建立固相萃取-高效液相色譜二極管陣列檢測器（DAD）同時測定大米中甲萘威和阿特拉津的方法。在0～2.0 μg/mL范圍內，2種化合物均呈現良好的線性關系，甲萘威曲線方程為y=377.405 3x+4.064 5，相關系數R2=1.000，檢出限1.0 μg/kg；阿特拉津曲線方程為y=178.245 1x+2.113 4，相關系數R2=1.000，檢出限3.0 μg/kg。對低、中、高3種不同濃度下甲萘威和阿特拉津準確度和精密度試驗，回收率分別為88.3%～102.2%和87.5%～104.3%，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為1.2%～3.3%和2.3%～4.7%。該方法穩定性好，操作簡單，靈敏度高，滿足于大米中甲萘威和阿特拉津的測定。