固相萃取-液質聯用測定辣椒粉中蘇丹紅

周勸娥，王玉，杜小強，劉倩，譚椰子

甘肅平涼市食品檢驗檢測中心（平涼 744000）

近年來，非法添加和濫用合成染料已成為食品安全領域的主要隱患。蘇丹紅作為一類人工合成的親脂性偶氮系列化工合成染色劑[1]，由于其色澤鮮艷、著色穩定、價格低廉，常被一些黑心廠家非法添加到辣椒油、辣椒醬和火鍋底料等辣椒制品中，以達到長期保持色澤、不易褪色的目的[2]。經食物從口中攝入是蘇丹紅染料進入機體的主要途徑[3]，大量的蘇丹紅在機體內不斷堆積，會對肌體造成不可逆的損傷，更有甚者會引發癌癥[4-5]。目前，國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）已將蘇丹紅I歸為三類致癌物；歐盟也發布了辣椒制品里禁止非法添加蘇丹紅染料的禁令[6]；我國先后發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單》第一批和第五批[7]也將蘇丹紅列為禁止在食品中添加的物質。

蘇丹紅的添加量一般情況下較少，在復雜的食品基質中要準確地檢測到極少劑量的蘇丹紅，對于檢測技術的靈敏度、回收率以及重現性等指標都要求頗高[8]。目前，常用于檢測蘇丹紅的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法、超高效液相-質譜法、氣相色譜-質譜法和凝膠滲透色譜法等[9-14]，其中高效液相色譜法被列入國家標準，但實際操作中該方法存在操作耗時長、流動相復雜、結果重現性差、假陽性（圖1）等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇丹紅Ⅰ（99.9%）、蘇丹紅Ⅱ（99.7%）、蘇丹紅Ⅲ（94.8%）、蘇丹紅Ⅳ（99.6%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、正己烷、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純，德國MERCK公司；試驗用水為一級超純水；試驗用辣椒粉為市售。

1.2 儀器與設備

Agilent Infinity II G6460C型超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（UPLC-MS/MS），美國Agilent公司；MV5型水浴氮吹儀，北京萊伯泰科有限公司；XH-C型旋渦混合器，上海馳唐電子有限公司；SB-80超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TD5M型多管架自動平衡離心機，上海盧湘儀器有限公司；SQP賽多利斯分析電子天平，賽多利斯（上海）貿易有限公司；SPE-12A固相萃取裝置，北京成萌偉業科技有限公司；蘇丹紅分子印跡固相萃取小柱（500 mg/6 mL），北京中檢維康技術有限公司。

圖1 標準品的色譜圖（A）與光譜圖（B）、樣品的色譜圖（C）與光譜圖（D）

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確量取100 μL的一級標準混合母液（100 μg/mL），用乙腈定容至10 mL，配制成1 μg/mL的二級儲備液，放置冰箱備用。

1.3.2 樣品溶液的配制

1.3.2.1 提取

準確稱取0.5 g辣椒粉于15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，在渦旋儀上渦旋混合1 min，超聲提取5 min，以3 000 r/min離心5 min，取上清液；重復提取3次，合并上清液，在40 ℃下氮吹濃縮至4 mL，備用。

1.3.2.2 凈化

用5 mL正己烷活化蘇丹紅分子印跡柱，將上述濃縮液加入到小柱中，用5 mL正己烷淋洗，棄去流出液，再用5 mL乙酸乙酯進行洗脫，收集洗脫液，氮吹至進干，用1 mL乙腈定容，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）柱；流動相A為0.2%甲酸水溶液；流動相B為乙腈；流速為0.2 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為2 μL，梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。

表1 UPLC 梯度洗脫程序

1.3.4 質譜參數

離子源，電噴霧電離（ESI+）；掃描方式，多反映監測（MRM）；干燥器溫度350 ℃；干燥氣流量7 L/min；霧化器壓力45 psi；毛細管電壓4 000 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

選擇ESI+電離方式，MRM掃描方式，以50 ng/mL的蘇丹紅混合標準溶液，分別對碎裂電壓及碰撞能量等參數進行優化，主要的優化參數見表2。4種蘇丹紅的總離子流圖見圖2。

表2 保留時間及串聯質譜參數

圖2 混合標準品總離子流圖

2.2 標準曲線和線性范圍

取一定量制備好的二級儲備液，配制成一系列不同濃度的蘇丹紅混合標準溶液，進樣量為2 μL，在上述色譜質譜條件下繪制工作曲線，分別得到蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號的線性回歸方程，結果如表3所示。

2.3 液相條件的優化

由于蘇丹紅分子結構中含有偶氮基團，在水相流動相中加入甲酸可防止色譜峰拖尾并提高電離效率。分別考察不同體積分子的甲酸（0.1%，0.15%和0.2%）對色譜圖的峰形和分離度的影響，結果發現，當甲酸添加量為0.2%時峰形較好，故選用乙腈-水（0.2%甲酸）溶液為流動相體系。

從圖3可以看出，4種物質完全得到分離，而且分析時間較短。蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的保留時間分別為1.654，2.478，3.034和2.174 min。結合圖2可知，1和6號小峰分別為Ⅲ和Ⅳ號的同分異構體，由于每個離子對的檢測通道不同，所以同分異構體的存在不影響各物質的外標法定量分析。

表3 蘇丹紅的線性回歸方程、線性范圍和相關系數

圖3 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ子離子掃描質譜圖

2.4 檢出限、回收率及精密度

根據國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）對檢出限的定義，將低濃度的混合標準品添加到陰性辣椒粉中，每個水平平行測定6次，計算各目標化合物峰面積的標準偏差，以3倍標準差計算各個化合物的檢出限（置信水平p=95%），選取檢出限最低的化合物所對應的結果作為方法的檢出限[15]。當4種蘇丹紅標準品的質量與陰性辣椒粉的質量比為5 μg/kg時，在儀器上有響應，且信噪比S/N＞3，因此確定5 μg/kg為該方法的檢出限。

在選定的上述液相和質譜的最佳條件下，以辣椒面為樣品基底，考察不同加標濃度下的回收率，平行測定3次，結果見表4。在10，50和100 μg/kg 3個添加水平下，辣椒粉樣品中4種物質的回收率在86.5%～102.2%之間，平行樣品間δRSD為1.5%～6.0%，可以滿足日常分析要求。

表4 4種蘇丹紅不同加標水平下回收率測定結果

3 結論

此次試驗建立了分子印跡固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測辣椒粉中4種蘇丹紅染料的方法。在該方法下4種蘇丹紅染料在4.5 min內即可實現快速分離檢測；當質量濃度為1～50 ng/mL時，4種化合物線性相關良好且相關系數均在0.999 0以上；當加標濃度為10，50和100 μ g/kg時，其平均回收率在86.5%～102.2%之間，且相對標準偏差均小于6%，滿足4種蘇丹紅同時檢測的需要。該方法與GB/T 19681—2005的高效液相色譜法相比，大大減少了有機溶劑的用量，縮短了試驗時間，在一定程度上有效彌補了國標法重復性差、易出現假陽性的不足。該方法簡單快速、經濟可靠、靈敏度高、環境友好，適用于辣椒粉中蘇丹紅的定性定量分析。