青花椒揮發油固體脂質納米粒的制備及質量評價

王茹嫣，許路路，趙鳳平，趙宇明，韓靜*

沈陽藥科大學制藥工程學院（沈陽 110016）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc，Z.schinifolium）也被叫作川椒、青椒，是蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物中的一種，有溫中助陽、散寒躁濕、止癢、驅蟲等功能[1]。青花椒的化學成分主要有10%揮發油、10%山椒素、20%黃酮類等，并且具有良好生物活性[2]。在青花椒揮發油的組分分析和生物活性上，揮發油中85%芳樟醇與5%檸檬烯是其發揮抑菌作用的主要成分[3]，并且對革蘭氏陽性菌有顯著抑菌作用[5]。Hellen等[4]認為長期使用抗生素會激發真菌mdr2基因，導致ABC轉運體的表達增多，產生耐藥性。芳樟醇與抗生素聯用，會抑制mdr2基因表達，起到聯用效果。

青花椒揮發油容易被氧化從而失去生理活性，氧化程度20 mmoL/L僅能作為香水；同時揮發油氧化物對皮膚致敏，不可見的人體反應為250 mg/kg；可見的人體反應為1 000 mg/kg[6]。青花椒揮發油的水不溶性以及生物利用度差阻礙抑菌作用在臨床方面應用。

青花椒揮發油納米粒作為局部給藥制劑時，相較其他納米制劑，脂質體、納米乳、膠束等，優點包括：有效物質更好地免受外部物質的氧化；增強活性物質在角質層的滲透性；包封活性成分不易泄漏；可控釋放；生物可降解，對人體的毒性低。

這些優點為青花椒揮發油局部給藥制劑時在臨床上的研究與開發提供理論思路[7]。

1 儀器與材料

日立Primaide高效液相色譜儀；馬爾文激光粒度儀（英國Malvern公司）；ATY124精密電子天平（萬分之一，日本Shimadzu公司）；SHA-BA水浴恒溫振蕩器（江蘇科析儀器有限公司）；高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；高速多功能粉碎機（上海緣沃工貿有限公司）。

青花椒（云南泰瑞農林發展有限公司）；芳樟醇對照品（上海麥克林生化科技有限公司）；棕櫚酸（九鼎化學有限公司）；單硬脂酸甘油酯、硬脂酸（天津市博迪化工有限公司）；gelucire 44/14、LABM 2125 CS、geclucire 50/13（嘉法獅貿易有限公司）；丙三醇、乙醇、吐溫20、吐溫40（天津市富宇精細化工有限公司）；吐溫80（天津市科密歐化學試劑有限公司）；泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407（阿拉丁控股集團有限公司）；十八醇（瑪雅試劑有限公司）；PEG 400（國藥集團化學試劑有限公司）；1, 2-丙二醇（天津市永大化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 揮發油測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜條件：日立Supersil ODS C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長205 nm；流動相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃，進樣量10 μL[8]。

2.1.2 標準曲線

精確稱取0.06 g芳樟醇對照品，用乙腈溶解后定容轉移到10 mL容量瓶中得72.5 mg/mL母液。精確量取一定母液，用乙腈稀釋成0.011，0.022，0.033，0.044，0.055，0.071 5和0.088 mg/mL標準稀釋溶液。以芳樟醇質量濃度（x）對峰面積（y）作線性回歸，得回歸方程y=2×107x-19 548（R2=0.999 6）。結果表明在0.011～0.088 mg/mL藥物質量濃度內的線性關系良好。

2.1.3 樣品處理

取100 g花椒顆粒放入燒杯中，用高速多功能粉碎機進行粉碎，過篩，參照藥典揮發油提取法提取青花椒揮發油，液料比10∶1（mL/g），時間4.5 h，提取次數3次，用燒杯接住揮發油提取器的油層，用5 mL左右的乙酸乙酯沖洗管壁，沖掉殘余油相，加入無水硫酸鈉靜置24 h除去水分得到青花椒揮發油[9]。

2.2 青花椒揮發油納米粒包封率（EE）的測定

取0.5 mL載藥固體脂質納米粒溶液置于超濾管（規格0.5 mL，100 kDa）膜中，蓋外蓋，超濾管置于5 mL離心管，置于10 mL離心管，以3 500 r/min離心10 min，收集所有下層濾液至10 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋，定容；另取0.5 mL固體脂質納米粒溶液，至10 mL量瓶中，加入乙腈進行破乳溶解，定容。分別取上述兩種溶液過0.22 μm有機濾膜，得到續濾液，用2.1.2的方法進行測定，按式（1）計算包封率。

式中：Cfree游離為SLNs溶液中未被包封的青花椒揮發油質量；Ctotal為SLNs溶液中青花椒揮發油總量[10]。

2.3 青花椒揮發油納米粒的制備

青花椒揮發油納米粒采用微乳法制備，將高熔點脂質載體在65～70 ℃加熱融化，加入藥物、表面活性劑及助表面活性劑，加入10 mL溫水制成外觀透明、熱力學穩定的微乳，將微乳分散在20 mL冷水中，即得SLNs分散體系[11]。

2.4 處方優化

2.4.1 單因素考察

2.4.1.1 脂質載體

選用不同類型的脂質材料：棕櫚酸、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、gelucire 44/14、gelucire 50/13、LABM 2125 CS，表面活性劑吐溫80，助表面活性劑丙三醇，按照2.3的方法制備青花椒揮發油納米粒。對SLNs的表觀、包封率進行觀察。結果發現gelucire 50/13的現象與gelucire 44/14類似，呈現澄清泛藍，但是gelucire 50/13的包封率更高，故選擇gelucire 50/13為脂質載體。

表1 不同脂質材料對青花椒揮發油納米粒表觀、包封率的影響

2.4.1.2 表面活性劑

選用吐溫20、吐溫40、吐溫80、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407為表面活性劑；脂質載體gelucire 50/13，助表面活性劑丙三醇，按照2.3的方法制備青花椒揮發油納米粒，對SLNs的表觀、包封率進行觀察。根據表2結果，選擇吐溫80作為表面活性劑。

表2 不同表面活性劑對青花椒揮發油納米粒的表觀、包封率的影響

2.4.1.3 助表面活性劑

選用十八醇、PEG 400、丙三醇、1, 2-丙二醇、乙醇為助表面活性劑；脂質材料G50/13，吐溫80為表面活性劑。按照2.3的方法制備青花椒揮發油納米粒，對SLNs的表觀、包封率進行觀察。如表3所示，選擇丙三醇作為助表面活性劑。

2.4.2 Box-Behnken設計-響應面法優化試驗

考察丙三醇助表面活性劑質量濃度（X1，g/L）、藥脂比（X2）、吐溫80表面活性劑質量濃度（X3，g/L）對青花椒揮發油納米粒的粒徑與包封率的影響，采用Box-Behnken設計-響應面法優化試驗方法，以納米粒的粒徑、包封率作為評價指標，優化納米粒處方，并得到最佳處方配比。其因素與水平見表4，試驗安排及結果見表5。

表3 不同助表面活性劑對青花椒揮發油納米粒表觀、包封率的影響

表4 Box-Behnken試驗設計中的變量水平

表5 試驗設計中的自變量（X）和因變量（Y）

2.4.3 數據處理及模型擬合

應用Design Expert 8.0.6試驗軟件對表5中試驗結果進行方差分析及多元二次方程擬合，結果詳見表6。多元二次回歸方程可表示為Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3+β11X12+β22X22+β33X32，其中βi代表不同的回歸系數。從表6的F值可以看出，藥脂比對粒徑、包封率的影響遠大于表面活性劑與助表面活性劑；表面活性劑與助表面活性劑的交互作用較好。

應用Design Expert 8.0.6試驗軟件對表5中試驗結果繪制響應面圖以及等高線圖。結果如圖1（等高線圖）所示，表面活性劑在3.67～4.67 g/L之間質量濃度增加導致粒徑減少，很大可能是因為表面活性劑濃度決定納米粒的總比表面積、擴散速度。在設定的處方范圍內繼續增加表面活性劑濃度會使粒徑增大，因為濃度過大會抑制其移動速度，從而使乳化液滴聚結。

表6 固體脂質納米粒擬合方程中各項系數及方差分析結果

圖1 自變量A、B、C與因變量粒徑、包封率的等高線圖

2.4.4 優化與預測

根據Design-Expert 8.0.6試驗設計軟件得到的最佳處方為丙三醇質量濃度3.67 g/L、藥脂比6∶1、吐溫80質量濃度4.67 g/L。按照最優處方制備3批青花椒揮發油固體脂質納米粒，分別測定粒徑（Y1）和包封率（Y2），并與模型給出的預測值進行比較（見表7）。由結果可知，試驗觀察值和模型預測值的偏差的絕對值較小，不超過6%，說明模型預測的可行性良好。

表7 青花椒揮發油固體脂質納米粒各指標預測值和觀察值

2.4.5 粒徑分布

使用最優配比制備納米粒，儲存條件：25 ℃，避光，30 d；粒徑儀測量納米粒，圖2所示粒徑30.34nm，PDI 0.307，表明納米粒粒徑分布較窄。

圖2 青花椒揮發油固體脂質納米粒的粒徑分布

2.5 SLNs的體外經皮滲透試驗

2.5.1 離體皮膚制備

于小鼠腹部涂抹脫毛膏進行脫毛處理后，用生理鹽水洗凈，飼養24 h后處死，剝離無毛的腹部皮膚，去除皮下脂肪，用生理鹽水洗凈，用濾紙吸干后，備用。

2.5.2 體外透皮吸收試驗

圖3 SLNs和原料藥的體外滲透曲線

在直立式Franz擴散池中進行透皮吸收試驗，于37 ℃恒溫循環水浴中保溫。將2.5.1處理好的小鼠離體皮膚固定在供給池和接收池中間，角質層部分朝向供給池，以生理鹽水溶液作為接收液。取1.0 mL優化的SLNs及相同質量濃度的原料藥作為對照，在300 r/min攪拌條件下，并于一定時間點吸取200 μL接收液，另取相同體積的生理鹽水置于接收池中[12]。吸出的接收液經0.22 μm微孔濾膜濾過后，按2.1.1的色譜條件分析。從體外滲透曲線圖（圖3）可以看出，納米粒與原料藥相比有明顯促進藥物吸收作用，11 h后納米粒積累滲透量25.02 μg/cm2，是原料的3.16倍。

3 討論與結論

采用Box-Behnken設計響應面法優化試驗，得到丙三醇質量濃度3.67 g/L，藥脂比6∶1，吐溫80質量濃度4.67 g/L，測得的粒徑28.76±1.56 nm，PDI 0.108±0.023，EE 92.24%±3.48%。透皮試驗結果顯示，SLNs的累積滲透量提高約3.16倍，表明將原料藥制成SLNs可顯著提高其透皮性能[13]。可能的原因是納米粒更易粘附在角質層表面，形成藥物存儲庫，通過被動運輸可達到皮膚深處；納米粒的小粒徑增大與角質層的接觸面積。存放30 d后的納米粒粒徑仍可達30.34 nm，PDI為0.307，表明Box-Behnken法獲得的最優配比具有一定的穩定性、可行性。