響應面法優(yōu)化苦菜蛋白質(zhì)提取工藝

賀瑩

呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）

苦菜（Sonchus oleraceusL.）系菊科苦苣菜屬，一年生或二年生草本植物，莖直立或斜生，折斷有白色乳汁，基生葉羽狀深裂，全形長橢圓形或倒披針形，葉片邊緣呈鋸齒狀；瘦果褐色，為長圓形，助間有橫皺紋[1]。苦菜主要含有16種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的43%，從苦菜中提取分離出的蛋白質(zhì)，無動物蛋白所含的膽固醇，營養(yǎng)價值高，易于被人體吸收，具有十分廣闊的市場潛力和前景[2-3]。

目前苦菜產(chǎn)品的開發(fā)正處于起步階段，苦菜乳酸飲料[4]、苦菜復合果蔬汁、苦菜凍干粉等苦菜產(chǎn)品的推出深受消費者的喜愛。但苦菜在其蛋白質(zhì)資源、產(chǎn)品加工等方面研究的深度不夠，這就極大限制了對苦菜的深度應用開發(fā)。我們需要加深對苦菜蛋白質(zhì)的研究，為苦菜進一步開發(fā)利用提供技術(shù)和理論支持，因此課題的研究成果有一定實用價值[5-6]。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與設備

苦菜：采于山西呂梁田間；考馬斯亮藍G250，牛血清蛋白（BSA）；氫氧化鈉、酚酞以及氯化鈉分析純，天津鳳船化學試劑科技有限公司。

L550型離心機，金壇市恒豐儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋、HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風干燥箱（101-2A），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BSA224S電子天平、PHS-3E pH計，上海精密化學儀器有限公司。

1.2 試驗研究方案

1.2.1 蛋白含量測定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法[7]測定：采用UV-3100PC型紫外可見分光光度計，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白，以吸光度為縱坐標率，各標準液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，見圖1，并建立回歸方程為

式中：Y為吸光度；X為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，μ g/mL。

1.2.2 原料處理

將采摘的新鮮苦菜清洗干凈并稱質(zhì)量，然后將其置于80 ℃電熱鼓風干燥箱中風干5 h，將風干的苦菜用高速粉碎機粉碎，過孔徑0.180 mm篩，置于一次性干燥密封袋備用[8-9]。

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線圖

1.2.3 苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝

提取工藝流程：原料采摘清洗→風干→粉碎→鹽溶→調(diào)pH→加熱浸提→過濾→離心分離→上清液（蛋白質(zhì)提取液）→測定。

操作要點：準確稱取1 g苦菜樣品置于燒杯中，加入0.2 mol/L的氯化鈉溶液，用1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH，然后將其置于恒溫水浴鍋中攪拌提取[10]，一段時間后將其取出進行過濾，然后將濾液于6 000 r/min下離心15 min，3次，合并上清液，進而采用考馬斯亮藍法測定上清液中苦菜蛋白質(zhì)的含量。

1.2.4 單因素試驗

以苦菜中蛋白提取量為指標，研究pH、料液比、提取溫度和提取時間4個因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響，每個試驗重復3次。

1.2.4.1 pH對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間2.0 h條件下，研究不同pH 2.6，2.8，3.0，3.2和3.4對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.2 料液比對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，提取溫度60 ℃，提取時間2.0 h條件下，研究不同料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.3 提取溫度對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取時間2.0 h條件下，研究不同提取溫度55，60，65，70和75 ℃對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.4 提取時間對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃條件下，研究不同提取時間1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4個因素，以苦菜蛋白質(zhì)提取量（Y）為指標，設計四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗[11-12]，探索苦菜蛋白質(zhì)提取的最佳工藝參數(shù)。試驗因素、水平見表1。

1.2.6 計算公式

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0繪圖軟件繪制單因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響趨勢圖，采用Design-Expert 7.0軟件進行響應面試驗設計與分析，試驗安排見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖2可知，在料液比1∶20 g/mL，提取溫度60℃，提取時間2.0 h條件下，隨著pH的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量也隨之發(fā)生變化，pH為3.0時苦菜蛋白提取量開始增加，pH為3.2時苦菜蛋白質(zhì)提取量達到峰值；隨著pH的逐漸升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量開始呈現(xiàn)下降趨勢，因此，試驗選取pH 3.2為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適pH。

圖2 pH對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.1.2 料液比對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖3可知，在提取溫度60 ℃，pH 3.0，提取時間2.0 h，不同料液比條件下，苦菜蛋白質(zhì)提取量整體呈先增加后減少的趨勢，在料液比為1∶25 g/mL時苦菜蛋白質(zhì)提取量最高，其他比例蛋白提取量相對較低。綜合考慮，試驗選取1∶25 g/mL為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適料液比。

2.1.3 提取溫度對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖4可知，在料液比1∶20 g/mL，pH 3.0，提取時間2.0 h，不同提取溫度條件下，苦菜蛋白質(zhì)提取量隨提取溫度的升高而增加，這是由于苦菜蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增大。當提取溫度為65 ℃時，苦菜蛋白質(zhì)提取量為3.42 mg/g。提取溫度達到65 ℃后，苦菜蛋白質(zhì)的提取量隨著提取溫度的升高而繼續(xù)增加，但增加的幅度明顯減慢，因此，提取溫度選擇65℃比較合適。

圖3 料液比對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

圖4 提取溫度對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.1.4 提取時間對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖5可知，在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃的條件下，隨著提取時間的增長，苦菜蛋白質(zhì)的提取量越大，當提取時間為2.0 h時，提取效果最好。當提取時間超過2.0 h時，苦菜蛋白質(zhì)提取量開始下降，說明提取時間過長會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而使得苦菜蛋白質(zhì)的提取量下降。因此，試驗選取2.0 h為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適提取時間。

圖5 提取時間對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

綜合上述單因素試驗結(jié)果，選取pH、料液比、提取溫度及提取時間為考察因素，根據(jù)響應面分析法中心組合設計原理進行響應面試驗，苦菜蛋白質(zhì)提取工藝的響應面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立

利用Design-Expert 7.0軟件對響應面試驗結(jié)果進行多元回歸分析，得到苦菜蛋白質(zhì)提取量與pH（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）的二次回歸模型為

式中：各項系數(shù)的絕對值的大小表示各影響因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響大小，系數(shù)的正負表示該因素影響的方向，各因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響由大到小依次為B＞C＞D＞A。

對回歸模型進行方差分析（表3），可以看出模型p=0.000 6＜0.01，表明該模型具有極顯著性，說明條件不同，苦菜蛋白質(zhì)的提取量有顯著差異；失擬項p=0.134 1＞0.05，說明在試驗所選各因素水平范圍內(nèi)，擬合程度好，此模型可用于對試驗結(jié)果進行分析和預測。從表3可以看出，在試驗所選各因素水平范圍內(nèi)，B影響極顯著（p＜0.01），C影響顯著，A、D影響不顯著，二次項A2，B2，C2和D2對模型影響極顯著。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應曲面分析

由圖6可知，隨著提取pH的升高、料液比的增大，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢。由圖7可知，隨著pH的遞增、提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢。由圖8可知，隨著提取時間的增長，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢；隨著pH的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量也呈現(xiàn)逐漸升高后下降趨勢。由圖9可知，隨著提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢；隨著料液比的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量也呈現(xiàn)逐漸升高后下降趨勢。由圖10可知，隨著提取時間的增長，提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢；隨著料液比的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量同樣呈現(xiàn)先升高后趨于平緩。由圖11可知，隨著提取時間的增長，提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢；隨著提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量同樣呈現(xiàn)先升高后趨于平緩。由此可知，各因素之間交互作用的影響與單因素影響不一致，各因素間交互作用對響應值影響不顯著。

圖6 pH與料液比交互作用的響應面與等高線

圖7 pH與提取溫度交互作用的響應面與等高線

圖8 pH與提取時間交互作用的響應面與等高線

圖9 料液比與提取溫度交互作用的響應面與等高線

圖10 料液比與提取時間交互作用的響應面與等高線

圖11 提取溫度與提取時間交互作用的響應面與等高線

2.2.4 最佳提取條件驗證

由Design-Expert 7.0軟件對工藝條件進行優(yōu)化，分析可得苦菜蛋白質(zhì)提取量的最佳試驗條件是pH為3.23，料液比1∶26.15 g/mL，提取溫度65.4 ℃，提取時間2.51 h，在此條件下的理論提取量為3.5 mg/g。根據(jù)上述優(yōu)化提取條件的試驗結(jié)果，為了操作方便，將苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝條件調(diào)整為pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取溫度65 ℃，提取時間2.5 h，經(jīng)過3次平行試驗，得到最佳條件下苦菜蛋白質(zhì)提取量為3.54 mg/g，與理論苦菜蛋白質(zhì)提取量無顯著性差異，由此說明通過響應面優(yōu)化得到的回歸方程模型及最佳條件可靠。

3 結(jié)論

以苦菜為原料，采用鹽溶、酸熱綜合方法提取苦菜蛋白質(zhì)，通過單因素試驗設計，得到各因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響趨勢圖，在此基礎上通過四因素三水平響應面優(yōu)化試驗設計，全面且直觀地分析了各因素對苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響，以及各因素之間的交互作用，建立回歸模型，經(jīng)驗證該模型合理可靠，表明影響苦菜蛋白質(zhì)提取量的主要因素是料液比與提取溫度。苦菜蛋白質(zhì)最佳提取工藝條件為pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取溫度65 ℃，提取時間2.5 h，經(jīng)驗證試驗，得到苦菜蛋白質(zhì)的提取量為3.54 mg/g。試驗得到的工藝參數(shù)可為生產(chǎn)應用提供參考。