微生物檢驗(yàn)研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)

王偉麗

（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541199）

在諸多領(lǐng)域的工作中都涉及微生物檢驗(yàn)環(huán)節(jié)，如食品、藥品等的檢驗(yàn)，對(duì)保障相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要作用。微生物檢驗(yàn)也是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重要手段，根據(jù)檢測(cè)需要和實(shí)際情況采取相應(yīng)的微生物檢驗(yàn)手段能更好地提升微生物檢驗(yàn)效果與水平，這就需要相關(guān)人員不斷深入研究微生物檢驗(yàn)技術(shù)，把握好微生物檢驗(yàn)的發(fā)展趨勢(shì)，使其在相關(guān)工作中得到更好的應(yīng)用。

1 微生物檢驗(yàn)技術(shù)概述

微生物檢驗(yàn)主要是對(duì)部分產(chǎn)品（一般是口服的食品、藥品）中的微生物污染開(kāi)展定性或者定量檢驗(yàn)的技術(shù)。該技術(shù)涉及諸多領(lǐng)域與行業(yè)，如食品、飲用水、外用或口服的藥品、需滅菌的產(chǎn)品和化妝品等，此類(lèi)產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)有明確的規(guī)定，通過(guò)微生物檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)其微生物污染實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格控制，避免各類(lèi)有害病原微生物侵入人體而對(duì)廣大消費(fèi)者的健康造成危害。在微生物的常規(guī)檢驗(yàn)中，主要的測(cè)定內(nèi)容有需氧菌的總數(shù)、霉菌的總數(shù)、腸道的致病菌、化膿性的致病菌、食物的中毒菌、破傷風(fēng)的厭氧菌、活螨蟲(chóng)和螨蟲(chóng)卵以及大腸菌群等。在微生物檢驗(yàn)中，一定要嚴(yán)格執(zhí)行檢驗(yàn)的程序，在樣品檢驗(yàn)前一定要對(duì)操作的環(huán)境提前采取滅菌處理，操作期間謹(jǐn)防出現(xiàn)二次污染[1]。

在微生物檢驗(yàn)中，基本操作有接種、分離純化、培養(yǎng)、鑒定和保存等。在接種方面，常用的方法有劃線(xiàn)接種、三點(diǎn)接種、穿刺接種、澆混接種、涂布接種、液體接種、注射接種、活體接種等。對(duì)培養(yǎng)基完成高壓滅菌后，通過(guò)已滅菌處理的工具在無(wú)菌條件下進(jìn)行含菌材料向培養(yǎng)基上接種。在分離純化方面，若一個(gè)菌落內(nèi)的所有細(xì)胞都來(lái)自一個(gè)親代細(xì)胞，此菌落就被稱(chēng)作純培養(yǎng)。在鑒定菌種時(shí)，用到的微生物要求是純培養(yǎng)物，而純培養(yǎng)物的獲取就是分離純化的過(guò)程，方法也有很多，如傾注平板、涂布平板、平板劃線(xiàn)、富集培養(yǎng)、厭氧處理、單細(xì)胞分離等。在培養(yǎng)方面，以培養(yǎng)時(shí)對(duì)氧氣的需求情況為標(biāo)準(zhǔn)，可以分為好氧培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)；以培養(yǎng)基的物理狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)，可以分為固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。在鑒定方面，主要涉及形態(tài)學(xué)的觀察、生理生化的試驗(yàn)、化學(xué)成分的分析、基因型的分析、系統(tǒng)發(fā)育的分析等內(nèi)容。在保存方面，基本原理是挑選優(yōu)良的純培養(yǎng)物，使其處于休眠狀態(tài)，然后人為創(chuàng)造有利于其休眠的環(huán)境，使其在長(zhǎng)期保存后依然具備菌種原有的優(yōu)良特性[2]。比較常用的方法有定期移植方法、液體石蠟方法、真空冷凍干燥法、低溫凍結(jié)方法等。

2 基因檢測(cè)在微生物鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展

在微生物鑒定中，基因檢測(cè)是一種新技術(shù)，目前已經(jīng)研究出下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS），此方法主要是對(duì)大量DNA的小片段進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)特定算法對(duì)個(gè)體檢測(cè)的數(shù)據(jù)與參考基因的序列實(shí)施對(duì)比，發(fā)現(xiàn)可能存在的變異情況。以醫(yī)學(xué)臨床中的微生物檢驗(yàn)為例，NGS可以用于感染性疾病病原體的鑒定。對(duì)病原微生物的傳統(tǒng)鑒定方法主要包括涂片鏡檢處理、分離培養(yǎng)、質(zhì)譜和生化反應(yīng)等，但此類(lèi)方法呈現(xiàn)出周期長(zhǎng)、靈敏度低和過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)，對(duì)分枝桿菌的菌種鑒定用時(shí)需30～40 d，對(duì)苛養(yǎng)菌、病毒等的培養(yǎng)條件也極為苛刻，大大增加了培養(yǎng)的難度。分子診斷基于聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）有效解決了上述病原體的鑒定問(wèn)題，但不能解決未知的微生物檢驗(yàn)難題，因?yàn)槲粗奈⑸锖怂嵝蛄幸参粗瑹o(wú)法設(shè)計(jì)引物，這也成為該技術(shù)最大的難題[3]。在NGS檢測(cè)中，不需要對(duì)病原體實(shí)施分離培養(yǎng)處理，也不依賴(lài)已知的核酸序列，能直接實(shí)現(xiàn)標(biāo)本的測(cè)序、鑒別，有效節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間、提升了診斷效率，在對(duì)未知物種和難培養(yǎng)病原體的鑒定中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。在對(duì)病原體的鑒定中，NGS的應(yīng)用主要包括兩種方法，分別是rRNA基因測(cè)序、全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS）。其中，rRNA基因測(cè)序法在臨床上主要用于細(xì)菌和真菌等鑒定，也是菌群分析環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)；WGS和rRNA基因測(cè)序方法相比，WGS能獲取更加全面的信息，適合在病毒的鑒定中使用。大部分的病毒是不可培養(yǎng)的，且存在高度變異的情況，NGS和基因芯片、Sanger測(cè)序法等相比，NGS具有更高的效率，也不需要設(shè)計(jì)特定探針，適用于復(fù)雜的臨床標(biāo)本病毒鑒定。

3 微生物鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展

微生物鑒定的定義是以現(xiàn)有的分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)未知微生物的特征實(shí)施測(cè)定，以對(duì)其實(shí)施細(xì)菌、霉菌和酵母菌等大類(lèi)區(qū)分，或?qū)佟⒎N和菌株水平進(jìn)行確定的過(guò)程。在鑒定污染微生物時(shí)，一般結(jié)合鑒定的水平合理選擇鑒定的方法。在微生物的鑒定中，傳統(tǒng)方法（經(jīng)典的生化反應(yīng)、革蘭氏染色的顯微鏡鑒別等）一般適用于大多數(shù)非無(wú)菌類(lèi)藥品的生產(chǎn)以及部分無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。但在藥品的微生物污染相關(guān)事件中，通過(guò)傳統(tǒng)的方法并不能滿(mǎn)足快速分型、準(zhǔn)確鑒定和溯源分析等需求，所以，研究分子生物學(xué)時(shí)產(chǎn)生的基因型鑒定法逐漸得到應(yīng)用[4]。

采用傳統(tǒng)技術(shù)鑒定表型主要包括菌落形態(tài)的觀察、染色、生化鑒定、顯微鏡檢查等環(huán)節(jié)，呈現(xiàn)出成本低和便于操作等優(yōu)點(diǎn)。但微生物表型存在一定的可變性，不同的生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)對(duì)其表觀形態(tài)產(chǎn)生影響，如不同培養(yǎng)基內(nèi)的微生物可能有不同的顏色。同時(shí)，傳統(tǒng)表型鑒定技術(shù)對(duì)人員經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)條件較為依賴(lài)，在一些生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)難度大、需特殊營(yíng)養(yǎng)的微生物鑒定中具有很大的局限性。隨著社會(huì)的發(fā)展，現(xiàn)代化的微生物鑒定技術(shù)逐漸在藥品污染的微生物鑒定、溯源分析以及污染調(diào)查等方面得到廣泛運(yùn)用，此類(lèi)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)傳統(tǒng)表型鑒定的拓展與豐富，如生化鑒定系統(tǒng)（如ⅤITEK和API的系統(tǒng)）、FTIR（傅里葉紅外光譜）、MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）、以碳源分析為基礎(chǔ)的全自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)、脂肪酸鑒定系統(tǒng)等，有效提升了微生物的鑒定效率和藥品質(zhì)量的控制水平。

隨著鑒定技術(shù)的發(fā)展，基因型鑒定技術(shù)被研發(fā)出來(lái)，這是一種以微生物的基因序列為基礎(chǔ)，對(duì)其分子實(shí)施生物學(xué)鑒定的技術(shù)，不依賴(lài)微生物的培養(yǎng)，是一種現(xiàn)代化的鑒定技術(shù)類(lèi)型。基因型鑒定技術(shù)和表型鑒定技術(shù)存在很大不同，其數(shù)據(jù)庫(kù)較為完善，能以微生物的遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)，通過(guò)差異分析對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，呈現(xiàn)出高效率、高準(zhǔn)確度和高通量等特點(diǎn)。在自然環(huán)境中，約有10%的物種能以分離培養(yǎng)的方法獲取，以微生物的培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)表型鑒定具有很大的應(yīng)用局限性，而采用基因型鑒定，以16S rRNA的高通量式測(cè)序法獲取的微生物群落信息就十分全面。當(dāng)然，基因型鑒定也有一定的缺陷，使用16S rRNA法時(shí)，不能對(duì)某些親緣較近、不明顯的特征序列類(lèi)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定；采用高通量的測(cè)序分析混合樣本時(shí)，不能有效排除已死亡的微生物干擾因素等[5]。

4 微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

在微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，逐漸產(chǎn)生了很多技術(shù)類(lèi)型，各有優(yōu)缺點(diǎn)。為了有效地彌補(bǔ)各檢驗(yàn)方式的缺陷，可以對(duì)多種方式實(shí)現(xiàn)聯(lián)合運(yùn)用。在選擇檢驗(yàn)方式時(shí)，需要綜合考慮相應(yīng)條件，特別是檢驗(yàn)中對(duì)靈敏度的要求。因此，提升靈敏度、消除假陽(yáng)性是檢驗(yàn)技術(shù)研究過(guò)程中的重要關(guān)注內(nèi)容。在計(jì)算機(jī)技術(shù)迅速發(fā)展的背景下，微生物檢驗(yàn)技術(shù)朝著高度自動(dòng)化以及簡(jiǎn)便快速的方向發(fā)展。目前，分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在自動(dòng)化的儀器聯(lián)合中，已經(jīng)被運(yùn)用于病原菌的診斷和鑒定、耐藥基因的檢測(cè)等方面。要想實(shí)現(xiàn)高質(zhì)、高效和價(jià)格低廉等有效統(tǒng)一，就要改變臨床中病原菌的檢驗(yàn)現(xiàn)狀以及傳統(tǒng)觀念，在各學(xué)科的交叉發(fā)展中，新型檢驗(yàn)技術(shù)也會(huì)越來(lái)越多。

近年來(lái)，新型技術(shù)得到了迅速發(fā)展，如電化學(xué)和比濁法等技術(shù)，可以對(duì)藥品內(nèi)的活微生物實(shí)現(xiàn)直接測(cè)定；固相細(xì)胞的計(jì)數(shù)法以及流式細(xì)胞的計(jì)數(shù)法等，能分析微生物細(xì)胞內(nèi)的特定成分。上述技術(shù)能提高藥品檢測(cè)的準(zhǔn)確性，也能保證檢測(cè)人員的安全，因此，應(yīng)用前景十分廣闊。基于技術(shù)的迅速發(fā)展，要想實(shí)現(xiàn)藥品中微生物檢驗(yàn)的進(jìn)步，還要完善檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，提升相關(guān)檢驗(yàn)人員的綜合素質(zhì)和專(zhuān)業(yè)水平。因?yàn)樗幤窓z驗(yàn)期間需要人工操作，操作人員的技術(shù)水平會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響。為了提升操作人員的技術(shù)水平，要對(duì)檢測(cè)人員開(kāi)展定期培訓(xùn)。目前，在藥品微生物的檢驗(yàn)中，軟硬件設(shè)備都得到了顯著改善，且藥品的微生物檢驗(yàn)技術(shù)也朝著標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，特別是對(duì)無(wú)菌制劑的研究已取得顯著成就，推動(dòng)著檢驗(yàn)項(xiàng)目和方法、藥典制定的依據(jù)等朝著更科學(xué)的方向發(fā)展[6]。

5 結(jié)語(yǔ)

微生物的檢驗(yàn)在諸多領(lǐng)域得到了應(yīng)用，也逐漸產(chǎn)生了很多檢驗(yàn)技術(shù)和方法，各有優(yōu)點(diǎn)與不足。為了促進(jìn)相關(guān)技術(shù)作用的充分發(fā)揮，還需要對(duì)檢驗(yàn)技術(shù)不斷進(jìn)行研究，把握好檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，推動(dòng)檢驗(yàn)技術(shù)的現(xiàn)代化發(fā)展。