人羊膜上皮細(xì)胞改善器官纖維化的研究進(jìn)展*

劉 敏 綜述，張臣臣，何希彪，尹熙惠，方成虎△ 審校

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，吉林 延吉 133000；2.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 延吉 133000)

人體組織器官在不利因素下發(fā)生損傷時，會激發(fā)自身保護(hù)機(jī)制，啟動膠原纖維修復(fù)、填充受損部位,使結(jié)構(gòu)及功能初步恢復(fù)[1]。病理狀態(tài)下或有害刺激持續(xù)存在時，炎癥、組織重塑和修復(fù)過程將不受機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成和降解失衡，最終演變?yōu)殡y以調(diào)控的、以纖維組織增生為主的過程，即器官纖維化[2]。心、肺、肝等重要器官發(fā)生纖維化時若未得到及時有效的治療，將造成器官硬化或器官衰竭，危害人類生理、心理健康，甚至危及生命。目前，器官移植是器官纖維化終末階段成效最顯著的臨床方案，但由于供體稀缺、存活率低、費(fèi)用高昂、移植后發(fā)生排斥及感染風(fēng)險高等問題[3]，并不能使大多數(shù)患者受益，故亟須尋找其他療效更顯著、應(yīng)用更安全、操作更簡單的治療方案。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，將具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞移植到纖維化的器官中，可以修復(fù)因過度纖維組織增生破壞的器官結(jié)構(gòu)和功能。人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)具有可塑性、多能干細(xì)胞特性、非致瘤性、低免疫原性等優(yōu)點，解決了傳統(tǒng)干細(xì)胞移植帶來的安全及倫理難題，成為當(dāng)前細(xì)胞替代治療器官纖維化的研究熱點。

1 hAECs的來源及特性

羊膜由上皮層、基底層和間質(zhì)層組建，是位于胎盤胎膜最內(nèi)層，厚度0.02～0.50 mm的半透明膜[4]。囊胚在胚胎發(fā)育5～6 d嵌入子宮并分化為上、下胚層，約第8天在上胚層近滋養(yǎng)層側(cè)出現(xiàn)羊膜腔，hAECs單層排列于腔側(cè)背面的上皮層，故hAECs由多能性上胚層分化而來[5]。由于hAECs發(fā)生先于原腸胚，即器官分化前，而且羊膜腔阻礙了器官形成信號作用于hAECs，故推測其存留較多干細(xì)胞特質(zhì)，具有可塑性[6]。足月剖宮產(chǎn)后的遺棄胎盤是hAECs理想的細(xì)胞源泉，2005年MIKI等[7]運(yùn)用酶消化法和差異黏附法分離hAECs進(jìn)行培養(yǎng)，并鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物及相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)hAECs存有維持干細(xì)胞分化能力的關(guān)鍵基因及胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，如OCT-4、NANOG、SOX-2、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81，證明了hAECs的胚胎干細(xì)胞特性。實驗進(jìn)一步對hAECs的可塑性進(jìn)行了探究，證實了hAECs具有向不同胚層細(xì)胞分化的能力，可以分化為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。

更重要的是，hAECs不表達(dá)端粒酶基因，其DNA染色體末端因失去端粒酶保護(hù)發(fā)生短縮，使DNA復(fù)制過程中斷，細(xì)胞增殖受阻，具有非致瘤性[8]。YANG等[9]采用無血清hAECs分離和培養(yǎng)方法，分別在非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠體內(nèi)靜脈注射低或高劑量hAECs，并載入B16-F10細(xì)胞(促進(jìn)腫瘤發(fā)生)后，對致瘤性問題進(jìn)行連續(xù)4個月的觀察，結(jié)果示無論低或高劑量hAECs注射，均未導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

胎兒在母體內(nèi)孕育而未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，很大程度上與羊膜參與構(gòu)成的免疫屏障有關(guān)。李娟[10]研究表明，羊膜具有低免疫原性，其對34例角膜潰瘍患者實施羊膜移植手術(shù)，術(shù)后均未發(fā)生明顯的排斥反應(yīng)。SAKURAGAWA等[11]發(fā)現(xiàn)，hAECs在使用誘發(fā)細(xì)胞表面抗原表達(dá)的γ-干擾素處理3 d后，未出現(xiàn)任何類型的表面抗原表達(dá)增加。INSAUSTI等[12]發(fā)現(xiàn)，hAECs能夠持續(xù)性表達(dá)非經(jīng)典的人白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)，該抗原通常表達(dá)于免疫赦免器官，如睪丸、卵巢、胚胎細(xì)胞。由此可見，hAECs具備安全、可靠移植的免疫學(xué)特性，即低免疫原性。

此外,hAECs還具有旁分泌功能，分泌多種類型的生長因子、趨化因子、血管緊張素(ANG)、白細(xì)胞介素(IL)及纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)，參與人體免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化及細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等過程[13]，可能在抗器官纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2 hAECs抗器官纖維化的臨床前研究

2.1心肌纖維化(MF) MF是缺血缺氧、代謝紊亂、微生物、毒物等危險要素侵害心肌細(xì)胞引起的膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)[14]。MF常見于高血壓、心肌梗死(MI)發(fā)生后，纖維組織增生，心肌和血管壁結(jié)構(gòu)重塑，造成心室彈性及順應(yīng)性降低、興奮-收縮耦聯(lián)異常、心臟射血及充盈受限，引發(fā)惡性心律失常和心力衰竭，增加心源性猝死的風(fēng)險[15-16]。目前，以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)為代表的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)抑制劑，以及鈣通道阻滯劑、β-受體拮抗劑、他汀類藥物，雖然能通過治療引起(或促進(jìn))纖維化的潛在心血管疾病，改善心室重塑，但并不能逆轉(zhuǎn)MF本身[15]。近年來，hAECs在心血管疾病方面的研究中取得較多進(jìn)展，為治療MF帶來希望。

早在2005年，MIKI等[7]就提出hAECs具有胚胎干細(xì)胞特性，可以在體外誘導(dǎo)條件下向中胚層的心肌細(xì)胞分化。隨后，張路等[17]在添加了5-氮雜胞苷和抗壞血酸鹽的培養(yǎng)基中，對hAECs進(jìn)行體外誘導(dǎo)12 d，分化后的細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測到心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Nkx-2.5、GATA-4，而未檢測到心肌特異性可收縮蛋白基因MHC，說明在體外誘導(dǎo)條件下hAECs可以分化為心肌樣細(xì)胞，但這些細(xì)胞尚不具備成熟心肌細(xì)胞的收縮功能。2012年，臨床首次對hAECs在體內(nèi)分化為心肌樣細(xì)胞進(jìn)行報道。FANG等[18]利用液氮對大鼠左心室進(jìn)行冷凍損傷，模擬MI發(fā)生，用CM-DiI標(biāo)記hAECs并注射到梗死區(qū)，4周后在壞死區(qū)域及周圍通過熒光顯微鏡追蹤到CM-DiI和MHC共表達(dá)的細(xì)胞，這些細(xì)胞經(jīng)過免疫印跡分析、RT-PCR技術(shù)，檢測到心臟特異性標(biāo)志物MHC、α-SMA、肌鈣蛋白Ⅰ及Nkx-2.5、GATA-4的表達(dá)，且數(shù)量均高于生理鹽水組，說明hAECs在體內(nèi)向心肌樣細(xì)胞分化，且表達(dá)與心肌細(xì)胞收縮功能相關(guān)的蛋白。同時正電子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描(PET-CT)結(jié)果示梗死面積減少，超聲心動圖示左室擴(kuò)張減輕、射血分?jǐn)?shù)提高，提示受損心臟功能得到改善。重要的是，該實驗發(fā)現(xiàn)hAECs可改善MI的獲益情況，能與臍帶血和脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞組相媲美。由此可見，hAECs移植后能夠縮小MI引起的纖維化面積、改善心室重塑、提高心功能，是細(xì)胞替代治療MF的理想細(xì)胞資源。

hAECs分化后的心肌樣細(xì)胞，雖然具有心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，但是移植后在受損組織微環(huán)境中存活率極低，僅檢測到3%[18]，故推測hAECs取得移植治療成效的關(guān)鍵并不是依靠其可塑性。SONG等[19]認(rèn)為，相比數(shù)量較少的心肌樣細(xì)胞，hAECs旁分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子可能在修復(fù)受損心肌過程中的作用更顯著。該團(tuán)隊雖然在MI模型的壞死區(qū)及周圍，檢測到大量能夠刺激血管新生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，但是并不能確定是哪些因子起到治療纖維化的作用。值得注意的是，hAECs產(chǎn)生的細(xì)胞因子在移植1周后表達(dá)明顯下降。因此，如何優(yōu)化hAECs的旁分泌特性及提高細(xì)胞因子的持續(xù)時間，將是下一步研究的重點問題。

2.2肺纖維化(PF) PF是肺血管內(nèi)皮或肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)損傷導(dǎo)致進(jìn)行性炎性反應(yīng)、肺組織彌漫性重構(gòu)及不可逆瘢痕形成的結(jié)果，可以造成肺組織硬化，彈性及順應(yīng)性下降，肺泡獲氧能力下降，甚至是呼吸衰竭[20]。吡非尼酮、尼達(dá)尼布等藥物治療只能減輕癥狀，不能延緩PF的發(fā)展，也無法提高生存率，致使許多患者仍會進(jìn)展到終末期[3]。

博來霉素(BLM)是臨床上常用的抗腫瘤藥物，用藥后增加體內(nèi)促纖維化因子的表達(dá)，造成肺組織內(nèi)ECM蛋白沉積，誘發(fā)肺部炎癥及纖維化，導(dǎo)致肺損傷和肺功能下降。MOODLEY等[21]利用鼻內(nèi)給予BLM，誘導(dǎo)SCID小鼠發(fā)生PF，構(gòu)建肺損傷模型，將小氣道生長培養(yǎng)基中的hAECs經(jīng)尾靜脈植入模型鼠體內(nèi)，檢測到大量NKx2.1和SPs在肺損傷處聚集。已知NKx2.1是肺發(fā)育早期標(biāo)志物，參與肺分支、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞形成；SPs是表面活性蛋白，能夠有利于降低肺泡表面張力。此外，超微結(jié)構(gòu)檢查顯示，分化后的細(xì)胞含有典型的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層體。這些結(jié)果表明，經(jīng)靜脈移植的hAECs可以歸巢到肺組織并分化為Ⅱ型肺泡上皮樣細(xì)胞。實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)BLM處理后IL-1、IL-2、IL-6、腫瘤生長因子(TGF)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)、TIMP-2及膠原蛋白表達(dá)增加，但在hAECs注射后這些指標(biāo)均有明顯降低，肺損傷和PF得到改善。因此，注射hAECs能夠減輕肺部炎癥及纖維化，改善肺泡獲氧能力。

HE等[22]通過薈萃PubMed和EMBASE關(guān)于“hAECs移植治療BLM所致PF”的臨床前研究，提出hAECs減輕PF可能是細(xì)胞歸巢、細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)作用的結(jié)果。具有肺上皮表型的hAECs通過歸巢至受損部位和轉(zhuǎn)分化為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，引起內(nèi)源性肺組織再生，使TGF-β等促纖維化因子減少，纖維化面積縮小。另一方面，hAECs通過旁分泌機(jī)制改變宿主的免疫微環(huán)境，引起免疫調(diào)節(jié)作用，使促炎、促纖維化因子表達(dá)減少，改善PF的治療效果。

2.3肝纖維化(HF) HF是由酗酒、病毒感染、毒性物質(zhì)或代謝產(chǎn)物沉積等原因引起的慢性肝損傷，也是多種肝臟疾病共同的終末期結(jié)局[23]。再生能力較強(qiáng)的肝組織在反復(fù)損傷的狀態(tài)下，自我修復(fù)能力被削弱，引起ECM蛋白沉積，假小葉形成，導(dǎo)致肝功能減退和門靜脈高壓癥等肝硬化表現(xiàn)，最終演變?yōu)楦伟⒏嗡ソ遊24]。肝星狀細(xì)胞(HSC)和Kupffer細(xì)胞對啟動和推進(jìn)HF至關(guān)重要。HSC能夠活化肌成纖維細(xì)胞，分泌ECM蛋白和促纖維化因子，加速纖維組織增殖；肝Kupffer細(xì)胞和單核細(xì)胞具有介導(dǎo)免疫損傷和吞噬清除能力，在慢性肝損傷期間持續(xù)向M2型極化，促使纖維化持續(xù)發(fā)展[25]。因此，調(diào)節(jié)HSC數(shù)量和巨噬細(xì)胞表型可能限制HF的發(fā)展。盡管如此，對于許多發(fā)展為肝硬化終末期的患者而言，除了肝移植外，尚缺乏有效的治療方法。雖然這類手術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是手術(shù)難度系數(shù)高、供體數(shù)量少、移植后反應(yīng)多等問題限制了其臨床應(yīng)用。過去10年的臨床前研究結(jié)果顯示，hAECs用于治療肝臟疾病具有潛力和優(yōu)勢，有望代替器官移植成為終末期肝病患者的更優(yōu)選擇[26]。

經(jīng)證實，hAECs在體內(nèi)外均可分化為多種類型的肝組織細(xì)胞[27]，包含肝細(xì)胞、HSC、膽管細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等，分化后細(xì)胞表達(dá)清蛋白、谷氨酰胺合成酶及細(xì)胞色素酶等基因，并表現(xiàn)出合成與分泌清蛋白、儲存糖原、促進(jìn)物質(zhì)代謝等成熟肝細(xì)胞的功能。此外，對四氯化碳誘導(dǎo)的HF模型進(jìn)行研究，將hAECs經(jīng)脾注射后，免疫組織化學(xué)顯示纖維結(jié)節(jié)及條索狀改變明顯減少，TGF-β1表達(dá)水平下降，血清谷氨酰胺合成酶降低，清蛋白增多，證明hAECs具有抑制纖維組織生成、減少肝內(nèi)纖維化面積、改善肝功能的治療作用[28]。

KUK等[29]向非酒精性脂肪肝模型體內(nèi)注射hAECs的條件培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，HF面積、HSC及巨噬細(xì)胞數(shù)量均減少，衰減的肝功能得到改善。hAECs的條件培養(yǎng)基與hAECs具有相似的治療效果，說明其中必然存在某些物質(zhì)能改善臟器功能、減輕纖維化，而這些物質(zhì)很可能是hAECs旁分泌產(chǎn)生的。這預(yù)示更經(jīng)濟(jì)、更簡單、更安全的無細(xì)胞治療將成為熱門研究領(lǐng)域。此外，具體是何種物質(zhì)、以何種途徑參與器官纖維化的治療，仍需要進(jìn)一步研究。

3 hAECs抗器官纖維化的臨床研究

近年來,hAECs治療器官纖維化的研究已經(jīng)進(jìn)展到臨床試驗階段。第1次臨床實驗在6例支氣管發(fā)育不良的早產(chǎn)兒身上進(jìn)行，目的是觀察hAECs移植后的安全性和有效性。在2018年的報告中顯示，接受靜脈注射hAECs的6例患兒，僅1例在細(xì)胞移植過程中發(fā)生了急性心肺不良反應(yīng)，改變細(xì)胞移植方法后，其余受試者均未見急性反應(yīng)事件[30]。在后來2年的隨訪期間，患兒沒有發(fā)生與細(xì)胞移植相關(guān)的不良后果，呼吸功能也得到了改善[31]。由此可見，hAECs移植治療十分安全,且具有一定程度的治療效果。近期，24例支氣管發(fā)育不良的早產(chǎn)兒接受了新的多中心劑量遞增試驗，正在進(jìn)行安全性評估和細(xì)胞因子檢測，結(jié)果預(yù)計在2022年公布[32]。目前，LIM等[33]正在進(jìn)行第一階段的試點研究，12例肝硬化代償期的患者經(jīng)靜脈注射同種異體hAECs，之后對患者的標(biāo)準(zhǔn)肝臟檢查、瞬時彈性成像和肝臟超聲結(jié)果進(jìn)行長期隨訪，評估靜脈注射hAECs的安全性和耐受性。這是首次在成人應(yīng)用hAECs治療HF的試驗，盡管隨訪結(jié)果尚未統(tǒng)計，但必將為2期和3期臨床試驗開辟道路。以上研究，預(yù)示著hAECs將在未來數(shù)年取得更大進(jìn)展，并成功用于臨床治療。

4 hAECs移植治療的新策略

盡管細(xì)胞替代治療在抗器官纖維化方面應(yīng)用前景廣闊，但是干細(xì)胞移植的存活率很低，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。hAECs經(jīng)循環(huán)進(jìn)入體內(nèi)，將歸巢至肺和肝，極少遷移到心臟，移植效率非常差[6]。心肌內(nèi)注射hAECs可提高其存活率，卻也只有3%[18]，可見hAECs等干細(xì)胞移植后很難存活，尋找提高存活率的方法尤為重要。據(jù)報道，對干細(xì)胞進(jìn)行缺氧缺血模擬、細(xì)胞微型包囊技術(shù)、基因改造及組織工程等移植前處理，可提高移植后存活率[34]。例如，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化及抗細(xì)胞凋亡作用的抗衰老基因，轉(zhuǎn)染至干細(xì)胞后，能顯著提高移植細(xì)胞的存活率及治療效果。向心力衰竭模型大鼠體內(nèi)，注射轉(zhuǎn)染了重組慢病毒介導(dǎo)的抗衰老基因(klotho基因)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可使細(xì)胞的存活率及旁分泌特性升高，進(jìn)一步提升其對MF的治療效果[35]。因此，klotho基因轉(zhuǎn)染hAECs可能成為未來hAECs抗器官纖維化的新方案。

hAECs的旁分泌作用是移植治療器官纖維化的主要機(jī)制之一。外泌體(Exo)是hAECs分泌形成的胞外囊泡，同樣具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、血管重建、抑制瘢痕形成等修復(fù)作用，成為細(xì)胞移植的新途徑[36]。其中，TAN等[37]用BLM構(gòu)建肺損傷模型，發(fā)現(xiàn)hAECs-Exo能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，抑制T細(xì)胞增殖，發(fā)揮減少肺部炎癥、纖維化及促進(jìn)內(nèi)源性肺修復(fù)的作用。此外，hAECs-Exo已經(jīng)證實能夠減輕肝臟疾病的嚴(yán)重程度[23]。目前，雖然缺乏hAECs-Exo對心臟疾病的研究，但是多種干細(xì)胞Exo已表現(xiàn)出對心臟的保護(hù)作用[38]，提示hAECs-Exo有治療心臟疾病的潛力，是抗器官纖維化的新策略。

5 小 結(jié)

器官纖維化是各種器官和組織受到持續(xù)性損傷刺激后，炎癥、組織重塑和修復(fù)過程在受損部位反復(fù)發(fā)生的最終結(jié)果。當(dāng)前的治療措施存在許多弊端和隱患，尋找安全有效的治療方案意義深遠(yuǎn)。羊膜作為妊娠后廢棄物，來源廣泛，取材便利，符合倫理，已經(jīng)成功用于治療眼病、皮膚病等臨床患者。hAECs位于羊膜上皮層，其可塑性、非致瘤性、低免疫原性及旁分泌特性用于細(xì)胞移植更具優(yōu)勢。近年來，已經(jīng)開展的大量關(guān)于hAECs臨床前研究，證明了hAECs抗器官纖維化的作用，而相關(guān)后續(xù)臨床研究也正在開展。

hAECs通過細(xì)胞歸巢、細(xì)胞分化及旁分泌機(jī)制，達(dá)到治療器官纖維化的作用。值得注意的是，hAECs分化而來的細(xì)胞在改善器官纖維化過程中并非占據(jù)核心地位，而hAECs旁分泌引起的免疫調(diào)節(jié)作用可能是至關(guān)重要的。hAECs通過改變內(nèi)環(huán)境中部分細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而減弱肌成纖維細(xì)胞的激活，抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的募集，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的極化，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs等，抑制ECM蛋白沉積，逆轉(zhuǎn)纖維化。另外，hAECs的條件培養(yǎng)基和Exo等衍生產(chǎn)物也具有減輕纖維化的效應(yīng)，成為細(xì)胞替代治療新的途徑。klotho基因轉(zhuǎn)染hAECs是提高移植細(xì)胞存活率、增強(qiáng)治療效果的新思路。

目前，hAECs治療器官纖維化的研究大多在細(xì)胞水平和動物模型中展開,由于缺乏對人體復(fù)雜的免疫系統(tǒng)及內(nèi)環(huán)境的完全模擬，若想將hAECs療法應(yīng)用于臨床仍需考慮許多問題。例如，hAECs植入人體后能否存活，是否可以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；存活率低，如何優(yōu)化儲存及提高存活時間；體外傳代過程中如何高效擴(kuò)增并維持細(xì)胞特性；細(xì)胞移植時的方式、途徑、時機(jī)、數(shù)量如何選擇；如何有效優(yōu)化hAECs的特性或提取hAECs的關(guān)鍵分泌物等。雖然，hAECs的臨床應(yīng)用存在許多尚未解決的難題，但相信未來臨床會陸續(xù)攻克這些問題，并成功將hAECs應(yīng)用于臨床治療。