廣州地區0～7歲兒童血清25羥維生素D水平檢測結果分析*

范雪蓮，曾梓建，蔡志梁，張喬軒，石文，劉冬冬，林海標

(1.廣州市海珠區婦幼保健院檢驗科，廣州 510240；2.廣東醫科大學醫學檢驗學院，廣東東莞523808 3.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510120)

25羥維生素D[25(OH)D]是固醇類衍生物，也是人體生長和發育過程中的必需元素。血液中25(OH)D的含量不僅在維持血清鈣濃度穩定和骨骼健康方面起著重要的生理作用，還可作用于胰腺細胞、心肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞以及免疫細胞等多種組織細胞。25(OH)D含量與呼吸系統疾病、心腦血管疾病、內分泌系統疾病、自身免疫病、腫瘤有關[1]。25(OH)D在體內的主要存在形式為25羥維生素D2[25(OH)D2)]和25羥維生素D3[25(OH)D3][2]，本研究采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)檢測血清中25(OH)D2和25(OH)D3水平，可準確反映人體25(OH)D的營養水平[3-4]。研究表明[5]，不同地區人體血清25(OH)D水平存在差異。但未見廣州地區相關報道，本研究通過對2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D檢測結果進行分析，初步了解廣州地區0～7歲兒童血清25(OH)D營養狀況。

1 對象和方法

1.1研究對象 選擇2018年2月至2019年6月在廣東省中醫院健康體檢的0～7歲兒童2 418例，其中男1 380例，女1 038例；季節劃分為：春季，3～5月；夏季，6～8月；秋季，9～11月；冬季，12～次年2月。所有研究對象身心健康，營養狀況良好，肝腎功能正常，排除患有遺傳病、先天性疾病等基礎疾病以及近1個月內有發熱等癥狀的兒童。

1.2標本采集與處理 上午8:00—11:00采集研究對象空腹靜脈血標本2～3 mL，2 h內離心分離血清，-20 ℃保存。

1.3主要儀器與試劑 Waters TQ-S串聯ACQUITY UPLC液相色譜質譜聯用儀(美國Waters公司)，Agela Technologies氮氣吹干器(天津博納艾杰爾科技公司)，25(OH)D校準液為美國國家標準技術研究所(NIST)標準物質SRM 972a[25(OH)D2和25(OH)D3，溶劑型]和SRM 972a(4濃度水平，血清基質)。純度為98.0%的25(OH)D3-23,24,25,26,27-13C5(99原子%13C)和純度為99.3%的25(OH)D2-6,19,19-d3(99原子%13C)作為內標物(ISs)(美國Sigma-Aldrich公司)。LC-MS級甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯(德國MereK公司)。硫酸鋅、甲酸(美國Sigma-Aldrich公司)。渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)，Eppendorf移液器(德國Eppendorf公司)，Thermo 高速冷凍離心機(美國Thermo 公司)，Simplicity UA超純水機(美國Millipore公司)等。

1.425(OH)D檢測及評價標準

1.4.1樣本處理 分別取待測樣本血清于15 mL離心管中并進行編號，然后分別加入10 μL內標工作液，渦旋混勻；往上述離心管中加入200 μL 0.2 mmol/L硫酸鋅溶液，振蕩混勻后室溫靜置10 min；加入500 μL甲醇震蕩混勻，蛋白質沉淀后加入1 mL正己烷/乙酸乙酯(2∶1)渦旋震蕩1 min后在4 000 r/min條件下離心10 min；各取900 μL上清液于新的離心管中，氮氣吹干；往離心管中加入200 μL 50%乙腈水復溶，4 000 r/min離心5 min，取上清液至進樣瓶中并編號，上機檢測。

1.4.2標準曲線配制 分別取1、5、10、20、50和100 ng/mL標準品溶液于15 mL離心管中并進行編號，然后分別加入10 μL內標工作液，渦旋混勻，取200 μL上述溶液于進樣瓶中并編號，上機檢測。

1.4.3評價標準 用LC-MS/MS測量25(OH)D2和25(OH)D3水平，根據血清25(OH)D2和25(OH)D3總量判斷維生素D營養狀況,當25(OH)D水平<50 nmol/L(20 ng/L)為缺乏；50 nmol/L(20 ng/L)≤25(OH)D<75 nmol/L(30 ng/L)為不足；75 nmol/L(30 ng/L)≤25(OH)D為充足[6]。

1.5統計學分析 采用SPSS 24.0統計軟件進行。用Kolmogorov-Smirnov test進行正態性檢驗。偏態分布的計量資料用M(P25，P75)描述；兩獨立樣本的比較用Mann-WhitneyU檢驗；多個獨立樣本的比較先用Kruskal-WallisH檢驗，相鄰組間兩兩比較用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.10～7歲兒童血清25(OH)D的總體分布 2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D水平為36.1(29.5，44.8)ng/L，其中缺乏組113例，占4.7%，不足組534例占22.1%，充足組1 771例，占73.2%，25(OH)D處于較低水平的占26.8%。見表1。

表1 2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D的分布

2.20～7歲兒童血清25(OH)D水平的性別間差異 0～7歲兒童血清25(OH)D水平男性高于女性(Z=-2.352，P=0.019)，且男性缺乏和不足比例低于女性，充足比例高于女性，差異有統計學意義(χ2=9.591，P<0.05)。見表2。

表2 不同性別0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.30～7歲兒童血清25(OH)D水平的年齡間差異 0～7歲兒童血清25(OH)D水平隨年齡增長呈下降趨勢；3～4歲、4～5歲、5～6歲、6～7歲血清25(OH)D水平均低于0～1歲、1～2歲、2～3歲(P均<0.05)；除5～6歲和6～7歲組間差異無統計學意義外(P>0.05)，其他各相鄰組間差異均有統計學意義(P均<0.05)；3～4歲、4～5歲、5～6歲、6～7歲血清25(OH)D缺乏和不足比例高于0～1歲、1～2歲、2～3歲，組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同年齡0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.40～7歲兒童血清25(OH)D水平的季節間差異 0～7歲兒童夏季血清25(OH)D水平最高，冬季25(OH)D水平最低，春季和秋季比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他各組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。冬季25(OH)D缺乏比例高于其他季節，夏季25(OH)D缺乏和不足比例最低，差異有統計學意義(P<0.05)；春、秋季節25(OH)D水平以及缺乏、不足的比例接近。見表4。

表4 不同季節0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.5不同年齡0～7歲兒童血清25(OH)D2的檢出率 0～7歲兒童25(OH)D2共檢出346例，檢出率為14.3%，其中0～1歲兒童血清25(OH)D2檢出率高于其他年齡段，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 0～7歲兒童血清25(OH)D2在不同年齡段的檢出率[n(%)]

2.60～7歲兒童血清25(OH)D2對評價維生素D營養狀況的影響 若僅采用血清25(OH)D3水平評價0～7歲兒童維生素D水平，缺乏率為7.2%，不足率為24.6%，而25(OH)D2的檢出使0～7歲兒童總體維生素D充足比例共上升5%。分析346例檢出25(OH)D2的結果，25(OH)D2使血清維生素D缺乏率降低了17.4%，不足率降低了17.3%，充足率提高34.6%。見表6。

表6 0～7歲兒童血清25(OH)D2對評價維生素D營養狀況的影響

3 討論

維生素D是人體正常發育必需的元素，其主要生理功能是維持血鈣及血磷的正常濃度[7]。維生素D還參與生殖、免疫、內分泌等方面的調節[8]。維生素D缺乏目前在國內外兒童中比較普遍，嚴重危害兒童的身體健康[9-10]。本研究通過分析0～7歲兒童血清25(OH)D水平與性別、年齡、季節的關系，了解廣州地區0～7歲兒童維生素D水平的營養現狀，以期為科學防治兒童維生素D缺乏提供依據。

本研究結果表明，2 418例0～7歲兒童中維生素D缺乏和不足比例占26.8%，與報道[11]一致。男童維生素D總體水平高于女童，且缺乏比例低于女童。戶外時間每天超過兩小時是維持維生素D正常水平的保護性因素[12]，男童相較于女童，更愿意參與戶外活動，進而提高了體內維生素D水平。不同年齡的兒童之間，維生素D水平存在一定的差異，0～7歲兒童血清25(OH)D水平隨著年齡的增長呈下降趨勢。可能原因為：0～3歲兒童通過補充維生素D或食入奶粉等相對3～7歲攝入量更多；而3～7歲兒童可能由于偏食、入學后戶外活動減少、機體對維生素D的需求增大等。結果還表明0～7歲兒童25(OH)D水平受季節的影響，夏季最高，冬季最低，春季和秋季水平接近。夏季兒童戶外接受紫外線照射的條件充足，而冬季兒童在戶外時間短，導致維生素D生成較少。廣州地區春秋季節不分明，可能受降雨的影響導致兒童戶外時間減少而使得25(OH)D水平低于夏季。

25(OH)D2的檢出對0～7歲兒童總體25(OH)D水平影響不大，僅使缺乏和不足比例共降低5%，但是在檢出的人群中可明顯減少25(OH)D的缺乏和不足比例。25(OH)D2的檢出有助于臨床精準判斷25(OH)D營養狀況并提供治療方案。目前維生素D檢測常用方法為免疫法和色譜法。免疫法在檢測維生素D時，各種25(OH)D代謝產物和類似物都能利用抗原抗體結合的原理發生反應，故只能檢測25(OH)D總的濃度，而不能區分25(OH)D2和25(OH)D3[13]。本研究采用的LC-MS/MS同時具備液相色譜的高分理性和質譜儀強大的分離鑒定能力，可區分25(OH)D2和25(OH)D3，對于醫生干預補充25(OH)D2有重要意義。

綜上所述，0～7歲兒童的維生素D水平與性別、年齡、季節有關。我們在臨床實際工作中，應更加注重女童維生素D的補充，應加強對3～6歲兒童維生素D水平的重視，觀察其飲食習慣和戶外運動情況。在陽光不充足的季節，應該及時對兒童維生素D水平進行調查，補充適當的維生素D制劑，以滿足身體需要。同時檢測25(OH)D2和25(OH)D3，對于客觀評價人體維生素D水平，營養狀況的評估以及疾病的發現和預防等有重要的臨床意義和社會價值。