液相色譜串聯質譜技術在載脂蛋白E室間質量評價中的應用

李卿，居漪，虞嘯炫，孫賀偉，虞科穎

(上海市臨床檢驗中心參考測量實驗室，上海200126)

載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)作為脂質轉運蛋白和低密度脂蛋白受體的主要配體，在膽固醇代謝和心血管疾病中發揮重要作用[1-2]。APOEε4等位基因是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的主要危險因素[3-5]。血清apoE增高與心血管疾病死亡率增加有關，而降低則與AD相關死亡率增加有關[3,6-7]。這些研究發現是基于免疫法，大多數是常規檢測中的免疫透射比濁法(immunoturbidimetry assay，ITA)。然而，基于免疫法的apoE的研究數據差異較大[8-10]，而基于液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS/MS)的研究數據一致程度較高[11-14]。LC-MS/MS在定義被分析物和抗干擾方面具有優勢，且在血清載脂蛋白的絕對定量上已有較為成熟的應用[15]，但未見其用于apoE室間質量評價(質評)中的報道。本研究首次使用已建立的血清apoE LC-MS/MS定量方法[16]，為室間質評樣品賦值，探討其在室間質評中的應用潛力。

1 材料和方法

1.1血清樣品 本中心2019年度EQA樣品，混合人血清，編號分別為sA、sB、sC、sD和sE。EQA樣品由冷鏈物流運輸，參加者使用日常檢測系統檢測1次。校準品為人血清制品，apoE含量為12.8～54 mg/L，由荷蘭萊頓大學醫學中心惠贈。

1.2主要儀器與試劑 分析系統包括Agilent 1290 Infinity超高效液相系統(美國Agilent公司)和AB5500 QTRAP三重串聯四級桿質譜儀(美國AB Sciex公司)。使用正離子模式和多反應監測(MRM)方法。Zorbax eclipse SB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美國Agilent公司)。

二硫鍵還原劑三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)購自美國Thermo Fisher公司，碘乙酰胺(IAA)、脫氧膽酸鈉(DOC)、Tris緩沖液購自美國Sigma-Aldrich公司。甲醇、甲酸為LC-MS級，分別購自法國Biosolve公司和美國Sigma-Aldrich公司。胰蛋白酶為測序級，購自美國Promega公司。實驗用水為Millipore超純水機所制(電阻率18.2 MΩ)。同位素標記多肽由國平藥業公司合成，純度>98%，標記位點為精氨酸的C和N。

1.3方法

1.3.1定量和定性肽段的選擇 根據本實驗室前期研究結果[16]，使用序列為SELEEQLTPVAEETR肽段作為定量肽段，LGPLVEQGR肽段為定性肽段，具體信息見表1。

表1 所用肽段信息及部分質譜參數

1.3.2胰蛋白酶酶解及質譜分析 樣品20倍稀釋后，依次加入0.523% DOC、2.3 mmol/L TCEP和14.3%同位素標記多肽于100 mmol/L Tris溶液中，56 ℃變性30 min。冷卻后，每支樣品加入4.6 mmol/L IAA 20 μL，室溫避光放置30 min。加入胰蛋白酶24 μL，37 ℃酶解；加入終止液(4.7%甲醇和0.6%甲酸的水溶液)終止。LC-MS/MS的LC部分：流動相A為5%甲醇和0.05%甲酸水溶液，流動相B為95%甲醇和0.05%甲酸水溶液；流速為0.2 mL/min；進樣5 μL。洗脫梯度：流動相B，0.0～6.0 min 15%～85%；6.0～8.0 min 85%；8.0～8.1 min 85%～100%；8.1～10.0 min 100%；10.1～15.0 min 100%～15%。LC-MS/MS的MS部分：離子對的選擇見表1。每個樣品檢測2次，取均值。

1.4統計學分析 采用統計軟件JMP 13.0繪制不同方法分組所對應的相對偏倚圖。相對偏倚=(參加者結果-LC-MS結果)/LC-MS結果×100%。對EQA結果計算不同方法組的均值和CV。

2 結果

2.1EQA結果 見表2。76家實驗室用ITA檢測sA、sB、sC、sD、sE樣品apoE結果分別為：15.7～20.8 mg/L、41.7～47.6 mg/L、63.9～69.7 mg/L、83.1～94.4 mg/L和112.9～129.7 mg/L。

表2 EQA結果

2.2不精密度和相對偏倚 sB～sE樣品，除瑞源外(CV>10%)，其他方法組內的不精密度為1.7%～8.8%。sB～sE樣品的總CV在8%左右。sA樣品的組內不精密度大于其他樣品，總CV為14.5%。積水的相對偏倚絕對值的均值最小，為8.7%，而藍怡最大14.6%，見表2。每種ITA的偏倚和CV均不相同，見圖1。高濃度樣品(sD和sE)比低濃度樣品(sA、sB和sC)更接近LC-MS/MS結果。

2.3EQA結果評價 以靶值±15%為判斷標準，不同品牌的合格率見表3。除積水外，其他品牌檢測sA樣品的合格率均為0.0%。隨著EQA樣品濃度的增高，多個品牌的合格率有逐步增高趨勢。

表3 不同品牌EQA結果評價合格率(%)

3 討論

本實驗室前期研究發現，LC-MS/MS法與免疫法具有較好的相關性(r=0.97)；LC-MS/MS法的不精密度為5.2%，與靶值的相對偏差為3.6%～7.6%[16]。本研究發現，除sA樣品外，sB～sE的ITA結果比LC-MS/MS結果低約6%；可能是apoE的基因型及兩種方法的特異性不同而造成。血清apoE含量在3種等位基因型之間(ε2,ε3和ε4)，區別較大?；蛐妥兓瘡摩?2、ε32、ε42、ε33、ε43至ε44，apoE含量逐漸降低，可降低約65%(即55 mg/L)。

簡單地說，絕對定量方法使用合成的同位素標記肽作為內標物，檢測樣品中天然肽的濃度。本研究使用了SELEEQLTPVAEETR作為定量肽段。實驗表明，3 h的酶解可實現該肽段的完全釋放。更重要的是，該肽段位于apoE2、apoE3和apoE4的共同區域，定量結果就是總apoE的水平。因此，相對于質譜法明確清晰的分析目標而言，免疫法可能會低估總apoE的含量。

血清apoE降低10 mg/L帶來的AD相關死亡率的風險比為1.7[6]。對于樣品sA、sB、sC、sD和sE，反饋結果相對于LC-MS結果降低10 mg/L以上的分別占27.6%、5.3%、28.9%、17.1%和21.1%，表明使用這些實驗室出具的報告，患者可能被錯誤分類為AD相關死亡風險增加。

當血清apoE在45 mg/L以上時，全因死亡率隨著apoE含量的增加而上升。sB樣品apoE為49 mg/L，接近于45 mg/L，以靶值±15%為判斷標準(參照美國CAP的載脂蛋白A和B的正確度驗證計劃的判斷標準)，86.8%的實驗室在此范圍內。

本研究使用的EQA樣品為混合人血清樣品，可能包括不同的ε2/ε3/ε4基因型，不能顯示ITA的特異性，對于結果在ITA和LC-MS之間的偏倚無法深入分析，采用單一來源人血清樣品可能會提供更多有價值的信息。